L’extraction au lysat de protéines : une technique pour lyser des organoïdes afin de collecter des protéines cellulaires

Le lysat cellulaire, ou le fluide contenant le contenu des cellules lysées, trouve une application dans les processus en aval tels que l’extraction et l’analyse des protéines. L’étude de ces fractions permet d’obtenir des informations sur les caractéristiques et les fonctions des cellules.

Pour préparer des lysats de protéines organoïdes, commencez par une culture d’organoïdes cultivés dans une matrice de membrane basale souhaitée. Retirez le milieu de culture usagé de la boîte. Ajoutez un milieu chaud contenant des protéases sur la matrice. Pipetez à plusieurs reprises pour déloger la matrice du plat.

Incuber le mélange. Les enzymes protéolytiques présentes dans le milieu dégradent la matrice et libèrent les organoïdes dans la solution. Centrifuger l’échantillon pour séparer les organoïdes du surnageant contenant l’enzyme.

Remettre en suspension la pastille organoïde dans un tampon de lyse protéique approprié. Incuber l’échantillon. Les détergents contenus dans le tampon perturbent les membranes cellulaires des organoïdes, libérant le contenu intracellulaire dans la solution. Parallèlement, les inhibiteurs de protéines dans le tampon inactivent toutes les enzymes protéase et phosphatase libérées, empêchant la dégradation de leurs protéines de substrat.

De plus, sonicez le mélange pour perturber complètement les cellules. L’enveloppe nucléaire se rompt et libère des protéines nucléaires dans la solution. Les ondes soniques cisaillent également les acides nucléiques libérés, les empêchant de contaminer le lysat de protéines.

Pour collecter des organoïdes, soufflez à plusieurs reprises le gel matriciel en pipetant 1 millilitre de milieu contenant de la dispase préchauffé directement sur l’anneau de gel matriciel jusqu’à ce que tout l’anneau soit délogé. Transférez le mélange d’organoïdes de gel matriciel délogé dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Après une digestion complète, comme décrit dans le protocole textuel, ajoutez une solution saline tamponnée au phosphate à la pastille organoïde et remettez en suspension en effleurant doucement.

Granulez les organoïdes par centrifugation à 800 x g pendant 5 minutes à température ambiante et retirez le surnageant à l’aide d’une micropipette. Remettre en suspension les pastilles organoïdes dans 100 microlitres de tampon de lyse des protéines pour 10 microlitres de volume cellulaire emballé. Effleurez pour remettre en suspension. Maintenant, sonifiez les organoïdes en immergeant les tubes dans de la glace humide et en appliquant doucement l’extrémité du démonteur sonique à l’extérieur du tube de la microcentrifugeuse. Sonicate pendant 40 secondes à 20 kHz avant de passer au western blot avec les protocoles établis.