Imagerie par immunofluorescence à monture entière : une technique de fixation et de coloration pour évaluer les organoïdes intacts

Les organoïdes de la prostate constituent principalement une couche externe de cellules épithéliales basales et des couches internes de cellules épithéliales luminales disposées autour d’une lumière centrale.

L’imagerie en monture entière permet d’étudier des organoïdes 3D intacts tout en conservant leur morphologie et leur hétérogénéité. Pour commencer la coloration, traitez les organoïdes avec un fixateur approprié pour verrouiller leurs composants cellulaires en place, les préservant ainsi. Lavez l’échantillon pour éliminer l’excès de fixateurs.

Incuber avec un cocktail de solution bloquante et de colorant colorant l’ADN. Les protéines de la solution bloquante se lient passivement à des sites non spécifiques des cellules et réduisent toute coloration de fond. En même temps, le colorant de coloration de l’ADN colore les noyaux des cellules.

Ajoutez deux ensembles d’anticorps primaires ciblant des antigènes spécifiques exprimés par les deux populations cellulaires constitutives. Incuber avec deux anticorps secondaires différents conjugués à un colorant fluorescent qui se lient aux anticorps primaires. Lavez l’échantillon pour éliminer tous les anticorps non liés.

Immergez séquentiellement les organoïdes colorés dans des concentrations croissantes de solutions sucrées contenant des tensioactifs pour améliorer la transparence des tissus sans compromettre l’architecture des organoïdes. Ce traitement améliore la profondeur d’imagerie de l’échantillon.

Montez les organoïdes sur une lame de microscope portant des entretoises pour préserver leur morphologie 3D pendant l’imagerie. À l’aide d’un microscope confocal, vous observerez les émissions de fluorescence des populations de cellules basales et luminales disposées autour de la lumière centrale.

Pour effectuer une coloration par immunofluorescence complète des organoïdes de la prostate, ajoutez d’abord 500 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS. Incuber les organoïdes pendant 2 heures à température ambiante en les secouant doucement. Après avoir lavé la pastille comme décrit dans le protocole de texte, ajoutez 1 microgramme par millilitre de colorant DAPI dans une solution bloquante et incubez pendant 2 heures à température ambiante. Protégez l’échantillon de la lumière pendant l’incubation à partir de ce pas en avant. Après la centrifugation des organoïdes comme précédemment, ajoutez l’anticorps primaire et la solution de blocage et incubez toute la nuit à 4 degrés Celsius en secouant doucement.

Granulez à nouveau les organoïdes et lavez les granulés avec 1 millilitre de PBS pendant 15 minutes en secouant doucement. Répétez cette procédure de lavage deux fois. Ensuite, ajoutez l’anticorps secondaire et la solution bloquante et incubez toute la nuit à 4 degrés Celsius en secouant doucement. Après l’incubation, granulez les organoïdes et lavez la pastille deux fois de plus. Ajouter 1 millilitre de saccharose à 30 % de PBS avec 1 % de Triton X-100 aux organoïdes granulés. Ensuite, incubez pendant 2 heures à température ambiante en secouant doucement.

Après avoir à nouveau granulé les organoïdes, ajoutez 1 millilitre de saccharose à 45 % dans du PBS avec 1 % de Triton X-100 et agitez doucement pendant 2 heures à température ambiante. Ensuite, répétez la procédure mais ajoutez 1 millilitre de saccharose à 60 % dans du PBS avec 1 % de Triton X-100. Granulez les organoïdes par centrifugation à 800 x g pendant 3 minutes à température ambiante et retirez 95 % du surnageant. Observez la pastille sous la lumière UV pour confirmer qu’elle n’a pas été perdue lors de l’élimination du surnageant. La pastille se détache à mesure que la concentration de saccharose augmente. Transférez 10 à 20 microlitres de la suspension restante dans une lamelle de couverture chambrée et passez à la microscopie confocale.