Caractérisation fonctionnelle de la chimiorésistance : une méthode pour évaluer la résistance aux médicaments dans les cellules cancéreuses à l’aide d’un test clonogénique

Pour évaluer la chimiorésistance dans les cellules cancéreuses, commencez par prendre une plaque à plusieurs puits. Ensemencez une suspension des cellules cancéreuses de la prostate sensibles aux médicaments souhaitées dans quelques puits et une suspension de la variante résistante aux médicaments des cellules dans les puits restants.

Incuber la culture pour faciliter la fixation des cellules à la plaque de culture. Traitez les deux types de cellules avec une gamme de doses croissantes de la solution médicamenteuse sélectionnée. Les molécules médicamenteuses pénètrent dans les cellules sensibles et provoquent la mort cellulaire même à leurs concentrations les plus faibles. Cependant, les cellules résistantes expulsent les molécules médicamenteuses à l’aide de pompes d’efflux de médicaments spécialisées, ce qui leur permet de survivre malgré leur exposition à des concentrations de médicaments plus élevées.

Aspirez le milieu usagé contenant les débris et la solution médicamenteuse. Complétez avec des milieux de croissance frais sans médicament. Incuber pour permettre aux cellules résistantes aux médicaments survivantes de proliférer et de former des colonies. Ajoutez une solution de coloration appropriée pour colorer les colonies de cellules vivantes.

Lavez la culture pour enlever l’excès de colorant. Comptez le nombre de colonies colorées dans chaque puits. Les puits contenant des cellules sensibles aux médicaments contiennent très peu de colonies viables. En revanche, les puits contenant des cellules résistantes aux médicaments présentent un nombre plus élevé de colonies. Cependant, ces cellules résistantes aux médicaments présentent une réduction du nombre de colonies avec l’augmentation des doses de médicament.

Dans cette procédure, plaquez 2 000 cellules en utilisant 2 millilitres de média par puits dans les plaques à 6 puits. Après 24 heures, ajoutez des concentrations croissantes de docétaxel pour les lignées cellulaires DU145 et 22Rv1. Ajouter du DMSO uniquement à un puits en tant que témoin au même volume que celui utilisé pour la dose la plus élevée de docétaxel. Après 72 heures, aspirez le milieu contenant du médicament et ajoutez-y un milieu frais sans docétaxel.

Incuber les plaques pendant 1 à 2 semaines jusqu’à ce que les colonies soient visibles au microscope. Pour colorer les colonies, lavez-les délicatement avec 2 à 3 millilitres de PBS et incubez-les avec 2 à 3 millilitres de solution de violet cristallin pendant 20 minutes à l’intérieur de la hotte de culture tissulaire ou d’une hotte.

Ensuite, retirez la solution de coloration et lavez les plaques avec 2 à 3 millilitres d’eau. Ensuite, retirez l’eau et faites sécher les plaques à l’air. Prenez des images numériques des plaques pour la représentation de figures. Analysez le résultat en visualisant les puits et en comptant manuellement les colonies à l’aide d’un marqueur et représentez le pourcentage de viabilité cellulaire dans un graphique.