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Recherche sur le cancer
0 vues • 4:50 min • April 30th, 2023
La phosphorylation de résidus d’acides aminés spécifiques, comme la tyrosine, génère des phosphopeptides qui jouent un rôle essentiel dans la régulation de plusieurs voies de signalisation cellulaire. Leur étude permet d’identifier des biomarqueurs potentiels pour le traitement du cancer.
Pour isoler les phosphopeptides, commencez par une poudre lyophilisée de digestats peptidiques purifiés extraits de tissus cancéreux. Remettre la poudre en suspension dans un tampon approprié pour préparer une suspension peptidique uniforme. Maintenez un pH neutre pour assurer la stabilité des peptides.
Préparez une suspension composée de billes d’hydrogel conjuguées à des anticorps anti-phosphopeptides spécifiques dans le tampon souhaité. Ajoutez la boue de billes à la suspension peptidique. Les anticorps immobilisés sur les billes reconnaissent et se lient à leurs résidus d’acides aminés phosphorylés spécifiques dans les phosphopeptides, formant des complexes.
Centrifuger le mélange pour recueillir les complexes phosphopeptide-billes dans la pastille. Retirez le surnageant contenant des peptides non liés ou des phosphopeptides non spécifiques. Ajoutez un tampon d’élution à faible pH approprié aux complexes et incuberez. Le faible pH affaiblit l’interaction entre les résidus de phosphopeptides et les complexes anticorps-billes, libérant les peptides dans la solution.
Transférez le mélange dans une cartouche filtrante pré-assemblée. Centrifugeuse pour éluer les phosphopeptides libérés dans le tube de collecte. Concentrez l’échantillon sous vide à une température élevée pour éliminer le tampon et obtenir une pastille sèche concentrée de phosphopeptides purs.
Remettez la poudre lyophilisée en suspension avec 0,5 millilitre de tampon de liaison par immunoprécipitation glacée, ou IP, dans chaque fraction. Transférez le volume de remise en suspension de 0,5 millilitre de la deuxième fraction dans le tube avec la première fraction et enregistrez la pointe de la pipette. Utilisez 0,5 millilitre supplémentaire de tampon IP pour rincer chaque tube de lyophilisation avant de transférer le contenu dans le cryotube. Ensuite, répétez le rinçage à l’aide de 2 millilitres de tampon IP.
Après avoir utilisé le P200 avec une pointe coupée pour transférer le stock de 0,5 milligramme par millilitre de boue de billes d’anticorps dans le tube de microfuge, ajoutez 450 microlitres de tampon de liaison IP glacé pour laver 50 microlitres de boue de billes d’anticorps 4G10 et 25 microlitres de boue de billes d’anticorps 27B10.4 dans un tube de microfuge. Centrifugez le tube à 100 x g et 4 degrés Celsius pendant 1 minute. Après avoir aspiré le surnageant, ajoutez un volume égal à celui de la boue d’origine de tampon de liaison IP pour remettre les billes en suspension. Ajoutez des billes de pY prélavées à la solution d’échantillon remise en suspension dans les cryotubes à bouchon à vis. Ensuite, incubez-les à 4 degrés Celsius sur un rotateur bout à bout pendant la nuit. Après avoir fait tourner les billes, conservez le surnageant, qui sera utilisé pour enrichir les peptides pST.
Ensuite, utilisez 300 microlitres de tampon de liaison IP pour remettre les billes en suspension et les transférer dans un tube de microcentrifugation de 2 millilitres. Faites tourner les échantillons à 100 x g et 4 degrés Celsius pendant 1 minute. Ensuite, avec 500 microlitres de tampon de liaison IP, lavez les billes trois fois. Lavez les billes quatre fois avec 450 microlitres de bicarbonate d’ammonium de 25 mM, pH 7,5. Trempez une pointe de chargement de gel légèrement sous la surface de la perle et aspirez complètement le surnageant. Ajoutez quatre fois le volume de billes de TFA à 0,1 % aux billes.
Ensuite, mélangez-les bien et incubez le tube dans un thermomélangeur à 1 000 tr/min et 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Transférez la remise en suspension dans un filtre à essorage de 0,2 micromètre et centrifugez le filtre à 850 x g pendant 1 minute. Après avoir transféré l’élution dans un tube de microcentrifugation à faible teneur en protéines, concentrez l’éluat sous vide jusqu’à ce qu’il soit sec à 40 degrés Celsius avec un temps de chaleur de 300 minutes pendant la nuit.