Conversion au bisulfite de l’ADN génomique : une méthode pour étudier la méthylation de l’ADN dans des échantillons d’ADN génomique provenant de tissus cancéreux gastro-intestinaux

La méthylation de l’ADN implique l’ajout de groupes méthyles aux résidus de cytosine de l’ADN pour former de la méthyl-cytosine, provoquant une altération de l’ADN et une régulation de l’expression génique.

Pour étudier la méthylation de l’ADN, commencez par prélever un extrait d’ADN brut de cellules cancéreuses. Ajouter un tampon de dilution et incuber à température ambiante. Le tampon dilue le mélange et dénature l’ADN double brin en ADN simple brin, favorisant l’accessibilité des bases pour les réactions ultérieures.

Ajoutez un réactif de conversion et incubez dans l’obscurité. Le bisulfite de sodium dans le réactif déclenche la sulfonation et la désamination ultérieure des résidus de cytosine non méthylés, entraînant la formation d’uracile-sulfonate. Cependant, les résidus de cytosine méthylée restent inchangés.

Ensuite, complétez l’ADN avec un tampon de liaison et transférez-le dans une colonne de filtre de spin pré-assemblée. Le tampon aide l’ADN à se lier au filtre.

Centrifugeuse pour retirer le mélange de tampon et de réactif de bisulfite de l’ADN piégé dans la colonne. Jetez le flux continu. Ajoutez un tampon de désulfonation alcalin à l’ADN. Le tampon aide à l’élimination du groupe sulfite de l’uracile-sulfonate pour former de l’uracile.

Centrifuger pour retirer le tampon usé. Maintenant, ajoutez un tampon d’élution à la colonne pour éluer l’ADN converti. Effectuez une PCR pour amplifier l’ADN. Tous les résidus d’uracile convertis s’amplifient sous forme de thymines, tandis que les résidus de cytosine méthylés s’amplifient sous forme de cytosines.

Séquencez les résidus de cytosine de l’ADN amplifié pour générer un profil de méthylation de l’échantillon.

Effectuez le traitement au bisulfite sur 45 microlitres de tissu digéré à l’aide d’un kit de conversion au bisulfite selon les instructions du fabricant. Ajoutez 5 microlitres de tampon de dilution à l’échantillon et incubez-le à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Pendant ce temps, préparez le réactif de conversion au bisulfite en ajoutant 750 microlitres d’eau distillée et 210 microlitres de tampon de dilution dans un tube de réactif de conversion CT. Mélangez les tubes en tourbillonnant pendant 10 minutes. Ensuite, ajoutez 100 microlitres du réactif de conversion CT préparé à chaque échantillon et mélangez par inversion.

Incuber les échantillons dans l’obscurité à 50 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures. Après l’incubation, placez les échantillons sur de la glace pendant 10 minutes. Ajoutez 400 microlitres de tampon de liaison et mélangez chaque échantillon en le pipetant de haut en bas. Chargez chaque échantillon dans une colonne de centrifugation et placez la colonne dans un tube de prélèvement de 2 millilitres. Centrifugez les échantillons à pleine vitesse pendant 1 minute et jetez le flux. Ajoutez 200 microlitres de tampon de lavage dans chaque colonne et essorez à pleine vitesse pendant 1 minute, puis jetez le flux.

Ajoutez 200 microlitres de tampon de désulfonation dans chaque colonne et laissez les colonnes reposer à température ambiante pendant 15 minutes. Après l’incubation, faites tourner les colonnes à pleine vitesse pendant 1 minute et jetez le flux. Lavez la colonne deux fois avec 200 microlitres de tampon de lavage, en centrifugeant pendant 1 minute à pleine vitesse après chaque lavage.

Ajoutez 46 microlitres d’eau distillée dans chaque colonne et placez-la dans un nouveau tube stérile en polypropylène à usage unique de 1,5 millilitre. Faites tourner les tubes pendant 2 minutes pour éluer l’ADN et jetez la colonne. L’ADN est maintenant prêt pour l’analyse. Utilisez l’ADN modifié au bisulfite comme modèle pour la PCR quantitative spécifique à la méthylation afin d’évaluer la méthylation de la région promotrice dans chaque analyse génique. Combinez les réactifs comme décrit dans le manuscrit et utilisez un instrument de PCR en temps réel à 96 puits pour exécuter le protocole de cyclage thermique.