Séparation des sphéroïdes pour la sous-culture et l’expédition : une procédure de propagation et de transfert de sphéroïdes à partir d’une tumeur neuroendocrine de l’intestin grêle

Les sphéroïdes sont des cultures in vitro de cellules auto-agrégées pour former des structures sphériques tridimensionnelles. Pour la propagation des sphéroïdes tumoraux, commencez par des sphéroïdes cultivés dans une matrice extracellulaire appropriée, ou ECM, contenue dans une plaque de culture.

Triturer à l’aide d’une micropipette pour casser mécaniquement l’ECM et détacher les sphéroïdes. Transférez le mélange sphéroïde-ECM dans un tube de microcentrifugation.

Centrifuger à basse vitesse pour granuler les sphéroïdes et les séparer de l’ECM dans le surnageant. Jetez le surnageant contenant l’ECM épuisé. Transférez le tube contenant la pastille sphéroïde sur de la glace pour éviter la solidification de l’ECM lors des étapes suivantes.

Complétez le granulé avec de l’ECM liquéfié frais. Pour la sous-culture, mélangez le contenu en pipetant de haut en bas à plusieurs reprises pour dissocier les cellules sphéroïdes et les libérer en suspension.

Semez ce mélange contenant des cellules sphéroïdes et de l’ECM dans une boîte de culture fraîche. L’ECM se solidifie, permettant de piéger les cellules tumorales. Ajoutez le milieu de croissance souhaité. Incuber pour faciliter la croissance des cellules piégées en nouveaux sphéroïdes.

Pour l’expédition, transférez le mélange sphéroïde-ECM dans une fiole de culture. Laissez l’ECM se solidifier et piéger les sphéroïdes à l’intérieur.

Remplissez le ballon de milieu de croissance pour éviter le cisaillement des cellules et pour maintenir la viabilité des sphéroïdes. Transférez le flacon dans un colis d’expédition.

Cassez mécaniquement l’ECM avec une pipette P1000 et transférez-la dans un tube stérile de 1,5 millimètre. Centrifugez le tube à 1 000 x g à 4 degrés Celsius. Ensuite, retirez tout le surnageant et placez le tube sur de la glace. Ajoutez deux à quatre fois le volume de l’ECM neuf à la pastille et mélangez le contenu du tube en pipetant 10 fois de haut en bas, en veillant à éviter d’introduire des bulles d’air.

Transférez 5 à 20 microlitres de l’ECM dans un mélange SBNET sur une nouvelle plaque de 96 puits et laissez l’ECM se solidifier. Ensuite, couvrez l’ECM solidifié avec un nouveau milieu SBNET et placez la plaque dans l’incubateur. Si vous expédiez des sphéroïdes SBNET à un autre laboratoire, transférez les sphéroïdes avec le nouvel ECM dans un flacon T25 et laissez l’ECM se solidifier. Remplissez le flacon avec du sphéroïde SBNET, vissez bien le capuchon et préparez le colis d’expédition.