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Recherche sur le cancer
0 vues • 4:59 min • April 30th, 2023
Les neutrophiles de basse densité, ou LDN, sont une sous-population distincte de neutrophiles que l’on trouve en grand nombre lors de conditions pathologiques comme le cancer gastro-intestinal. Les LDN peuvent être isolés des lavages de la cavité péritonéale ou du liquide de lavage des patients.
Tout d’abord, filtrez le liquide de lavage pour éliminer les débris tissulaires. Centrifuger le filtrat pour obtenir une pastille contenant des cellules sanguines, y compris des LDN. Le remettre en suspension dans un tampon approprié. Superposez cette suspension sur un milieu de gradient de densité approprié, optimal pour l’isolation LDN.
Centrifugeuse pour séparer les différents composants sanguins en fonction de leurs densités relatives. Les globules rouges les plus denses forment la couche inférieure, tandis que la fraction plasmatique la moins dense forme la couche supérieure. Les LDN moins denses occupent la couche intermédiaire avec d’autres cellules mononucléaires.
Transférez la couche intermédiaire dans un tube frais contenant un réactif de blocage. Les composants du réactif bloquent les sites de liaison non spécifiques à la surface de toutes les cellules non cibles et augmentent la spécificité de la LDN lors du marquage ultérieur.
Ajoutez des microbilles conjuguées à des anticorps ciblant une molécule de surface cellulaire spécifique surexprimée sur les LDN. Incuber pour que les complexes anticorps-billes se lient à leurs molécules cibles sur les LDN.
Faites passer la suspension incubée à travers une colonne placée dans un champ magnétique. Sous l’influence magnétique, tous les complexes de microbilles LDN adhèrent à la paroi de la colonne tandis que les cellules non marquées passent à travers.
Retirez la colonne. Rincez le contenu à l’aide d’un tampon approprié pour éluer et collecter la fraction contenant du LDN.
Pour acquérir les neutrophiles, perférez d’abord 1 litre de solution saline stérile normale immédiatement avant la fermeture de la plaie directement dans la cavité abdominale d’un patient qui vient de subir une chirurgie abdominale en raison d’une tumeur maligne gastro-intestinale, et lavez la cavité abdominale de manière extensive pendant au moins 1 minute. Ensuite, remuez la solution saline à l’intérieur de la cavité et récupérez 200 millilitres de liquide de lavage avec quatre seringues de 50 millilitres.
En laboratoire, transférez le liquide de lavage péritonéal à travers un filtre en nylon de 100 micromètres dans des tubes individuels de 50 millilitres pour la centrifugation. Remettez les granulés en suspension dans 5 millilitres de PBS complété par 0,02 % d’EDTA et superposez soigneusement chaque suspension cellulaire sur 3 millilitres de solution à gradient de densité. Après la séparation par gradient de densité, prélevez 2 à 3 millilitres de la couche intermédiaire de chaque tube et lavez les échantillons de liquide péritonéal dans 10 millilitres de PBS frais plus EDTA par tube. Versez les granulés dans 10 millilitres de PBS frais plus EDTA pour un lavage supplémentaire et diluez les cellules à 1 fois 10 à la septième cellule par 60 micromètres de concentration tampon de tri cellulaire activé magnétique, ou MACS.
Bloquez toute liaison non spécifique avec 20 microlitres de bloc Fc pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius, suivi de l’ajout de 20 microlitres de billes magnétiques anti-CD66b. Après 10 minutes à 4 degrés Celsius, lavez et remettez en suspension les cellules dans 500 microlitres de tampon MACS et ajoutez-les à une colonne magnétique de taille appropriée dans le champ magnétique d’un séparateur magnétique approprié. Lorsque toutes les cellules négatives CD66b ont traversé la colonne, ajoutez 15 millilitres de tampon MACS frais dans le réservoir de la colonne et transférez la colonne du séparateur magnétique dans un nouveau tube conique. Ensuite, plongez immédiatement la colonne pour rincer le CD66b positif marqué magnétiquement dans le tube.