Microscopie à fluorescence des pièges extracellulaires neutrophiles ou TNE : une technique pour observer l’interaction adhésive entre les cellules cancéreuses et les TNE
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0 vues • 3:15 min • April 30th, 2023
Dans des conditions pathologiques comme le cancer, les neutrophiles activés libèrent des pièges extracellulaires de neutrophiles ou TNE - un maillage d’ADN extracellulaire avec des enzymes associées et des protéines antimicrobiennes - qui piègent les cellules cancéreuses circulantes.
Pour visualiser l’interaction adhésive entre les TNE et les cellules tumorales in vitro, commencez par cultiver des neutrophiles de faible densité, un sous-type de neutrophiles, dans une boîte de culture recouverte de polymère qui favorise la fixation cellulaire. Incuber pendant quelques heures pour stimuler les neutrophiles à former des TNE en forme de toile.
Ajouter une suspension de cellules cancéreuses marquées à la fluorescéine rouge à la culture de neutrophiles. Incuber les cellules cancéreuses avec des TNE pendant une brève période pour faciliter l’interaction entre les cellules cancéreuses et les NET. L’ADN-TNE agit comme un facteur chimiotactique qui attire les cellules cancéreuses et favorise leur adhésion aux TNE.
Retirez le produit usé. Lavez doucement la culture avec un milieu frais approprié pour bien éliminer toutes les cellules tumorales détachées de la culture.
Maintenant, ajoutez une coloration nucléaire fluorescente verte imperméable à la membrane pour colorer les TNE extracellulaires de manière sélective. Observez la culture au microscope à fluorescence. Les pièges extracellulaires neutrophiles apparaissent comme des structures vertes ressemblant à des cordes qui forment un maillage auquel sont attachés des cellules tumorales rouges.
Remettre en suspension les neutrophiles isolés de faible densité à raison de 5 fois 10 à six cellules par millilitre de milieu RPMI 1640 complété par une concentration de FBS et ensemencer 1 millilitre de neutrophiles par puits sur une plaque à 6 puits recouverte de poly-L-lysine. Après 2 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, colorez les cellules de chaque puits avec un colorant nucléaire et chromosomique imperméable à la membrane fluorescente approprié selon les instructions du fabricant et observez immédiatement la morphologie des TNE par microscopie à fluorescence.
Pour évaluer l’adhésion des cellules tumorales aux TNE, mettez en suspension des cellules tumorales gastriques colorées avec un colorant fluorescent contrastant à raison de 1 fois 10 à six par millilitre de RPMI 1640 complété par une concentration d’albumine sérique bovine de 0,1 % et ajoutez 1 millilitre de cellules tumorales à chaque puits des cultures de neutrophiles à faible densité. Après 5 minutes à 37 degrés Celsius, retirez le surnageant de chaque puits et lavez doucement les cellules deux fois avec 2 millilitres de milieu RPMI 1640 préchauffé complété par BSA par lavage.
Une incubation de 5 minutes est suffisamment longue pour détecter la liaison spécifique aux NET. Ajoutez lentement le fluide chaud sur le côté de chaque puits, faites tourner doucement la plaque et retirez le surnageant à l’aide d’un aspirateur.
Les TNE et les cellules tumorales attachées peuvent ensuite être observées par microscopie à fluorescence.
Aperçu
Cette étude examine l'interaction entre les pièges extracellulaires des neutrophiles (NETs) et les cellules cancéreuses. Elle décrit une méthode in vitro permettant de visualiser cette interaction, en mettant en évidence le rôle des NETs dans l'adhésion des cellules cancéreuses.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Oncologie
Contexte
- Les neutrophiles peuvent libérer des NET dans des conditions pathologiques.
- Les NET sont constitués d'ADN extracellulaire et de protéines antimicrobiennes.
- Les NET pourraient jouer un rôle dans la capture des cellules cancéreuses circulantes.
- L'interaction entre les NET et les cellules tumorales est cruciale pour comprendre la progression du cancer.
Objectif de l'étude
- Visualiser l'interaction entre les NETs et les cellules cancéreuses in vitro.
- Évaluer les propriétés adhésives des NETs vis-à-vis des cellules tumorales.
- Comprendre les implications des NETs en biologie du cancer.
Méthodes utilisées
- Cultiver des neutrophiles à faible densité dans une boîte revêtue de polymère.
- Incuber les neutrophiles afin de stimuler la formation de NET.
- Ajouter des cellules cancéreuses marquées avec la fluorescéine rouge à la culture de neutrophiles.
- Utiliser la microscopie à fluorescence pour observer les interactions entre les NET et les cellules tumorales.
Résultats principaux
- Les NET ont été visualisées sous forme de structures filamenteuses vertes.
- Des cellules tumorales rouges ont été observées attachées aux NET.
- L'ADN des NET a agi comme un facteur chimiotactique favorisant l'adhésion des cellules cancéreuses.
- La microscopie à fluorescence a confirmé la liaison des cellules tumorales aux NET.
Conclusions
- Les NET favorisent l'adhésion des cellules cancéreuses in vitro.
- Cette interaction pourrait contribuer à la métastase cancéreuse.
- Des études supplémentaires sont nécessaires pour explorer les implications thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La visualisation des pièges extracellulaires des neutrophiles (NETs) et de leurs interactions adhésives avec les cellules cancéreuses répond à un défi crucial dans la compréhension de la dynamique du microenvironnement tumoral. Cette technique de microscopie de fluorescence permet l'observation directe des interactions cellule-matrice pertinentes pour la progression métastatique et la validation de cibles. La méthode soutient une dé-risquisation mécanistique à l'interface de l'immunologie et de l'oncologie, éclairant ainsi les décisions précoces relatives au portefeuille de projets.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'interrogation directe des mécanismes adhésifs médiés par les NET en biologie cellulaire du cancer.
- Permet la validation fonctionnelle de cibles en visualisant les interactions cellule-matrice in vitro.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques des hypothèses en immuno-oncologie impliquant l'activité des neutrophiles.
- Fournit des preuves permettant de hiérarchiser les cibles associées à l'adhésion cellulaire tumorale et à la métastase.
Développement de tests et criblage
- Établit un système in vitro reproductible pour quantifier l'adhésion des cellules cancéreuses aux NET.
- Permet la standardisation des lectures basées sur la fluorescence pour des protocoles de criblage en aval.
- Facilite le développement de tests pour des composés modulant la formation des NET ou la liaison des cellules tumorales.
- Offre une plateforme pour évaluer des molécules candidates dans un contexte contrôlé et quantitatif.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les résultats in vitro avec les mécanismes pertinents pour la maladie impliqués dans la métastase.
- Permet une continuité allant de la découverte à la validation préclinique de stratégies anti-métastatiques.
- Permet une progression ajustée au risque d'agents immunomodulateurs ciblant les NET.
- Facilite l'identification de biomarqueurs translationnels liés aux interactions entre NET et cellules cancéreuses.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode de microscopie à fluorescence s'intègre dans la continuité découverte-préclinique en permettant la vérification d'hypothèses sur les interactions immunitaires-tumorales et en soutenant l'identification de composés candidats pour des agents anti-métastatiques.
- Biologie de la découverte : Permet une visualisation directe de l'adhésion entre les NET et les cellules cancéreuses, clarifiant ainsi les mécanismes immunitaires impliqués.
- Écrantage : Fournit des résultats quantitatifs et reproductibles pour l'évaluation de composés ciblant les NET ou les voies d'adhésion.
- Analytique : Facilite la mesure de l'attachement cellulaire et de la formation des NET, permettant des analyses comparatives entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les connaissances mécanistiques obtenues in vitro et les modèles précliniques de métastase, sous réserve d'études complémentaires.
- Réutilisation en milieu professionnel : Offre une plateforme d'essai standardisée, adaptable à divers types de cellules cancéreuses et de modulateurs immunitaires.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en immuno-oncologie et la réduction des risques mécanistiques.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et l'évolutivité des tests d'adhésion cellulaire utilisant la microscopie à fluorescence.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions de poursuite ou d'abandon des programmes thérapeutiques immunomodulateurs et anti-métastatiques.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque des candidats ciblant les interactions tumeur-immunité.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microscopie à fluorescence et en techniques de culture cellulaire.
- Requiert un accès à des matériel de culture revêtu de polymère et à des colorants fluorescents validés.
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles de coloration et d'imagerie.
- Adaptable à différentes lignées cellulaires cancéreuses et sources de neutrophiles moyennant une optimisation du protocole.
- Limité à l'observation in vitro ; la pertinence translationnelle dépend de validations supplémentaires.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
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Dernière mise à jour : 22 août 2026