Microscopie à fluorescence des pièges extracellulaires neutrophiles ou TNE : une technique pour observer l’interaction adhésive entre les cellules cancéreuses et les TNE

Dans des conditions pathologiques comme le cancer, les neutrophiles activés libèrent des pièges extracellulaires de neutrophiles ou TNE - un maillage d’ADN extracellulaire avec des enzymes associées et des protéines antimicrobiennes - qui piègent les cellules cancéreuses circulantes.

Pour visualiser l’interaction adhésive entre les TNE et les cellules tumorales in vitro, commencez par cultiver des neutrophiles de faible densité, un sous-type de neutrophiles, dans une boîte de culture recouverte de polymère qui favorise la fixation cellulaire. Incuber pendant quelques heures pour stimuler les neutrophiles à former des TNE en forme de toile.

Ajouter une suspension de cellules cancéreuses marquées à la fluorescéine rouge à la culture de neutrophiles. Incuber les cellules cancéreuses avec des TNE pendant une brève période pour faciliter l’interaction entre les cellules cancéreuses et les NET. L’ADN-TNE agit comme un facteur chimiotactique qui attire les cellules cancéreuses et favorise leur adhésion aux TNE.

Retirez le produit usé. Lavez doucement la culture avec un milieu frais approprié pour bien éliminer toutes les cellules tumorales détachées de la culture.

Maintenant, ajoutez une coloration nucléaire fluorescente verte imperméable à la membrane pour colorer les TNE extracellulaires de manière sélective. Observez la culture au microscope à fluorescence. Les pièges extracellulaires neutrophiles apparaissent comme des structures vertes ressemblant à des cordes qui forment un maillage auquel sont attachés des cellules tumorales rouges.

Remettre en suspension les neutrophiles isolés de faible densité à raison de 5 fois 10 à six cellules par millilitre de milieu RPMI 1640 complété par une concentration de FBS et ensemencer 1 millilitre de neutrophiles par puits sur une plaque à 6 puits recouverte de poly-L-lysine. Après 2 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, colorez les cellules de chaque puits avec un colorant nucléaire et chromosomique imperméable à la membrane fluorescente approprié selon les instructions du fabricant et observez immédiatement la morphologie des TNE par microscopie à fluorescence.

Pour évaluer l’adhésion des cellules tumorales aux TNE, mettez en suspension des cellules tumorales gastriques colorées avec un colorant fluorescent contrastant à raison de 1 fois 10 à six par millilitre de RPMI 1640 complété par une concentration d’albumine sérique bovine de 0,1 % et ajoutez 1 millilitre de cellules tumorales à chaque puits des cultures de neutrophiles à faible densité. Après 5 minutes à 37 degrés Celsius, retirez le surnageant de chaque puits et lavez doucement les cellules deux fois avec 2 millilitres de milieu RPMI 1640 préchauffé complété par BSA par lavage.

Une incubation de 5 minutes est suffisamment longue pour détecter la liaison spécifique aux NET. Ajoutez lentement le fluide chaud sur le côté de chaque puits, faites tourner doucement la plaque et retirez le surnageant à l’aide d’un aspirateur.

Les TNE et les cellules tumorales attachées peuvent ensuite être observées par microscopie à fluorescence.