Microscopie à fluorescence time-lapse des pièges extracellulaires neutrophiles ou TNE : une technique pour analyser l’interaction post-adhésion entre les cellules cancéreuses et les TNE

Dans des conditions pathologiques comme le cancer, les neutrophiles activés libèrent des pièges extracellulaires de neutrophiles ou TNE - un réseau de fibres d’ADN extracellulaires associées à des histones et des enzymes protéolytiques. Ces structures piègent les cellules cancéreuses et jouent un rôle clé dans les métastases cancéreuses.

Pour étudier le comportement post-adhésion des cellules cancéreuses piégées dans les TNE in vitro, il faut d’abord cultiver des neutrophiles de faible densité - une sous-population de neutrophiles - dans une boîte de culture recouverte de polymère qui facilite la fixation des cellules. Incuber pour activer les neutrophiles afin de libérer des TNE semblables à des mailles.

Ensuite, ajoutez un colorant nucléaire fluorescent vert imperméable à la membrane pour colorer spécifiquement les fibres d’ADN dans les TNE. Retirez le produit usé. Ajouter une suspension de cellules cancéreuses à la culture de neutrophiles.

Incuber la culture pendant une courte période pour faciliter l’interaction entre les cellules cancéreuses et les NET. La composante ADN des TNE fonctionne comme un facteur chimiotactique qui stimule la migration des cellules cancéreuses et aide à leur adhésion aux TNE.

Retirez le produit usé. Rincez doucement la culture avec un milieu frais approprié pour éliminer toutes les cellules cancéreuses non liées de la boîte de culture. Régénérez avec un milieu frais contenant du sérum.

Imagez la culture pendant une durée prolongée à l’aide de la microscopie vidéo time-lapse pour analyser les événements interactifs entre les TNE et les cellules cancéreuses. Au fil du temps, les TNE fournissent un microenvironnement adapté facilitant la prolifération des cellules cancéreuses. Utilisez un logiciel approprié pour observer la prolifération des cellules cancéreuses sur les TNE fluorescentes vertes.

Cultivez et colorez les neutrophiles péritonéaux de faible densité dans une boîte de 35 millimètres, recouverte de poly-L-lysine, comme démontré, suivie d’un bref lavage dans 2 millilitres de BSA à 0,1 % plus RPMI 1640.

Remplacez le milieu par 1 fois 10 à la sixième cellules tumorales gastriques non colorées en suspension dans 2 millilitres de RPMI complété par BSA pour une incubation de 5 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, rincez les cellules dans 2 millilitres de RPMI frais complété par BSA pendant 5 minutes à température ambiante, suivi d’un léger tourbillon pour éliminer toutes les cellules tumorales non attachées.

Ensuite, remplacez le surnageant par du DMEM complété par du FBS et des antibiotiques et montez la boîte dans un système d’observation cellulaire à vue d’ensemble pour une analyse en accéléré du piégeage des cellules tumorales par les TNE.