Préparation de blocs d’exosomes : un protocole pour préserver les exosomes de cellules cancéreuses du côlon humain en culture

Les exosomes sont les structures vésiculaires extracellulaires qui sont sécrétées par les cellules cultivées dans le surnageant. Pour préparer un bloc d’exosomes, commencez par prendre un surnageant de culture contenant des exosomes dans un tube. Centrifuger le tube à grande vitesse pour granuler les exosomes intacts. Jetez le surnageant restant.

Traitez la pastille d’exosome avec du glutaraldéhyde présent dans le tampon de fixation. Incuber le mélange sur glace pendant le temps souhaité pour préserver la morphologie des exosomes. Le glutaraldéhyde s’infiltre dans les exosomes et réticule les protéines. Le tampon de fixation maintient les exosomes à pH neutre pour le processus de fixation en aval.

Jetez le tampon contenant du glutaraldéhyde et ajoutez une solution de tétroxyde d’osmium - un fixateur secondaire qui perméabilise la bicouche membranaire et fixe les lipides présents dans les exosomes. Retirez la solution de tétroxyde d’osmium et traitez les exosomes avec une série de concentrations croissantes d’acétone. Ce processus déshydrate les exosomes.

Remplacez l’acétone absolue par le mélange d’acétone moyenne. Progressivement, augmentez le rapport de milieu d’enrobage dans ce mélange.

Versez le mélange d’enrobage contenant des exosomes dans les moules souhaités. Faites sécher les moules au four à haute température. Cela conduira à la polymérisation du milieu d’enrobage autour des exosomes, donnant naissance à des blocs.

Pour fixer la pastille d’exosome purifiée, ajoutez 1 millilitre de glutaraldéhyde à 2,5 % dans une solution de cacodylate de sodium à 0,1 M à pH 7,0. Incuber les vésicules bicouches lipidiques pendant 1 heure à 4 degrés Celsius. Ensuite, retirez le fixateur et rincez les granules avec 1 millilitre d’une solution tampon de cacodylate de sodium 0,1 M à température ambiante pendant 10 minutes.

Ensuite, post-fixez les échantillons avec 1 millilitre de tétroxyde d’osmium à 2 % pendant 1 heure à 4 degrés Celsius. Retirez le fixateur et rincez la pastille d’exosome trois fois avec le tampon de cacodylate de sodium 0,1 M, en changeant le tampon toutes les 10 minutes. Ensuite, déshydratez l’échantillon en l’agitant pendant 10 minutes chacune selon une série de concentrations graduées d’acétone.

Ensuite, mélangez une solution composée de trois parties d’acétone et d’une partie de mélange d’enrobage à faible viscosité. Remplacez l’acétone par ce mélange et incubez l’échantillon pendant 30 minutes. Continuez à augmenter le rapport du milieu d’enrobage à faible viscosité, en incubant pendant 30 minutes à chaque étape.

Enfin, incubez la pastille d’exosome dans 100 % du mélange d’enrobage à faible viscosité pendant la nuit à température ambiante. Le lendemain, encastrez l’échantillon dans un mélange d’enrobage pur à faible viscosité à l’aide d’un moule d’enrobage et faites-le cuire pendant 24 heures à 65 degrés Celsius.