Isolement de cellules mononucléées Lamina Propria : une technique de centrifugation à gradient de densité à base de silice pour obtenir des cellules mononucléées à partir d’un côlon murin

La lamina propria intestinale, située sous l’épithélium intestinal, se compose de tissu conjonctif lâche ainsi que d’un réseau dense de fibres de collagène contenant un large éventail de cellules telles que les fibroblastes, les cellules mononucléées, y compris les lymphocytes et les monocytes. Ces cellules jouent un rôle crucial dans le maintien de l’homéostasie.

Pour isoler les cellules mononucléaires, commencez par prélever des fragments de côlon de souris. Traitez les fragments avec un tampon de digestion contenant des enzymes collagénase. Les enzymes collagénases digèrent les fibres de collagène dans les tissus, libérant les cellules en suspension.

Récupérez le surnageant et filtrez-le à travers des filtres cellulaires pour éliminer les tissus non digérés et les débris et obtenir une suspension unicellulaire. Ajoutez un tampon réfrigéré au filtrat pour inactiver les enzymes collagénase.

Centrifugeuse pour séparer les cellules. Jetez le surnageant contenant les enzymes et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de séparation à base de silice de faible densité. Ensuite, superposez la suspension sur un média de séparation à base de silice haute densité pour créer un gradient de séparation.

Centrifugez le mélange. Les cellules mononucléées se sédimentent et forment une couche blanche à l’interface entre les couches de gradient de densité. Transférez avec précaution la couche d’interface blanche dans un tube frais contenant un tampon approprié.

Centrifugeuse pour obtenir une pastille contenant des cellules mononucléées purifiées. Remettre la pastille en suspension dans le tampon pour une analyse plus poussée en aval.

Pour commencer, ajoutez 20 millilitres de tampon de digestion de la collagénase dans le tube contenant les fragments de côlon lavés. Fermez le tube et placez-le dans un agitateur orbital à 37 degrés Celsius avec une vitesse de rotation de 2 x g pendant 60 minutes. Assurez-vous que les fragments de tissu sont en mouvement constant pendant l’agitation.

Versez 5 millilitres de média de séparation à 66 % de densité à base de silice dans chacun des trois tubes en polypropylène séparés de 15 millilitres. Ensuite, utilisez une pipette sérologique de 25 millilitres pour prélever uniquement le surnageant de la digestion de la collagénase 1. Filtrez le surnageant à travers une crépine cellulaire en tissu de filtration de 40 microlitres placée dans un tube conique en polypropylène propre de 50 millilitres. Remplissez complètement le tube avec un tampon de digestion de côlon réfrigéré pour éteindre le tampon de digestion de la collagénase. Ensuite, faites tourner les cellules, aspirez le surnageant et gardez la pastille sur de la glace.

Continuez à effectuer la digestion de la collagénase 2 comme indiqué dans le protocole de texte. Une fois la digestion de la collagénase 2 terminée, rincez vigoureusement les fragments de tissu d’avant en arrière entre le tube et une seringue de 10 millilitres à travers une aiguille à bout émoussé de 18G. Répétez ce rinçage pendant au moins sept à huit passages, en continuant jusqu’à ce qu’aucun fragment de tissu grossier ou débris ne soit visible.

Ensuite, faites passer la suspension de désagrégation tissulaire à travers une crépine cellulaire en tissu de filtration des pores de 40 micromètres placée dans un tube en polypropylène propre de 50 millilitres. Remplissez le tube jusqu’au bord avec un tampon de côlon réfrigéré pour arrêter la digestion et centrifugez à 800 x g et à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes.

Jetez le surnageant par aspiration intra-utérine et tirez la pastille en suspension de la digestion 1 de la collagénase vers son tube correspondant. Après cela, remettre en suspension chaque pastille dans 24 millilitres de milieu de séparation à 44 % de densité de silice par côlon. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres, superposez lentement 8 millilitres de ce milieu sur chacun des trois tubes contenant un milieu de séparation de densité à 66 % de silice.

Équilibrez soigneusement les tubes dans les godets de centrifugation à l’aide d’une balance ou d’une balance. Centrifugeuse à 859 x g et à 20 degrés Celsius pendant 20 minutes sans pause. Laissez les rotors se reposer complètement avant de retirer les tubes, en prenant soin de ne pas perturber les cellules à l’interface du gradient.

Visualisez l’interface du gradient près de la marque de 5 millilitres où une bande blanche de 1 à 2 millimètres d’épaisseur est généralement présente. Aspirez sous vide et jetez les 7 millilitres supérieurs du gradient pour faciliter l’accès de la pipette à l’interface. À l’aide d’une aspiration manuelle continue et d’un mouvement de rotation régulier du poignet, collectez la couche d’interface des cellules. Collectez jusqu’à ce que l’interface entre les deux gradients soit claire et réfractaire, et transférez l’interface dans un nouveau tube conique en polypropylène de 50 millilitres.