Coloration de l’ADN extracellulaire : une méthode pour identifier l’ADN extracellulaire dans des coupes de tissus FFPE

Une cellule mourante libère une fraction d’ADN à l’extérieur de la cellule appelée ADN extracellulaire. Pour colorer l’ADN extracellulaire, commencez par prélever une coupe de tissu incorporée dans de la paraffine fixée au formol, ou FFPE, sur une lame de verre. Chauffez la lame de verre pendant la durée souhaitée. Cela facilite la fixation des tissus sur la surface de la lame et adoucit la paraffine environnante.

Plongez la lame dans un liquide de déparaffinisation pour dissoudre complètement la couche de paraffine autour du tissu. Ensuite, trempez la lame dans des concentrations décroissantes d’éthanol pour réhydrater le tissu déparaffinisé. Après la réhydratation, immerger la lame dans une solution bouillante de récupération de l’antigène. Ce traitement démasque les épitopes qui ont été altérés au cours du processus de fixation.

Superposez la lame avec des anticorps primaires et laissez-les se lier à des épitopes non masqués spécifiques présents sur la cellule. Ensuite, ajoutez des anticorps secondaires marqués par fluorescence, qui se lient aux anticorps primaires. Trempez la lame dans la solution Sudan Black pour réduire l’autofluorescence de fond.

Enfin, placez une goutte de support de montage complété par du DAPI sur la section du tissu et scellez-la avec une lamelle. Incuber pour permettre aux molécules DAPI de colorer l’ADN. Visualisez la coupe de tissu préparée à l’aide d’un microscope à fluorescence. Les épitopes marqués par fluorescence dans la cellule aident à différencier l’ADN nucléaire présent à l’intérieur de la cellule de l’ADN extracellulaire.

Pour la coloration extracellulaire de l’ADN, chauffez d’abord les échantillons d’intérêt dans le support à lames à 60 degrés Celsius pendant 60 minutes avant de les immerger dans deux changements de solvant de 40 minutes dans une hotte. Après la deuxième immersion, réhydratez les échantillons deux fois dans de l’éthanol à 100 % et une fois dans de l’éthanol à 70 % pendant 5 minutes par traitement.

Après le dernier traitement, à l’aide de pinces, placez les lames dans une solution bouillante de récupération d’antigène dans un autocuiseur à puissance élevée pendant 10 minutes. Après avoir démasqué les épitopes de l’antigène, transférez l’autocuiseur de la chaleur dans un évier et faites immédiatement couler de l’eau froide du robinet sur le couvercle.

Laissez les lames s’équilibrer pendant 20 minutes dans la solution de récupération de l’antigène avant de laver les échantillons deux fois dans du PBS à 0,01 molaire sur un agitateur orbital pendant 5 minutes par lavage. Après le deuxième lavage, utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner des cercles autour des échantillons de tissu rénal et bloquez toute coloration non spécifique avec 60 microlitres de sérum de poulet à 10 % dans de l’albumine sérique bovine à 5 % pendant 30 minutes à température ambiante.

À la fin de l’incubation, remplacez soigneusement la solution de blocage par 60 microlitres de l’anticorps primaire d’intérêt dans une chambre d’humidité pendant la nuit à 4 degrés Celsius. Le lendemain matin, lavez les lames sur un agitateur orbital dans du PBS pendant 2 minutes par lavage avant d’ajouter 60 microlitres d’un anticorps secondaire conjugué au fluorophore approprié à chaque lame pour une incubation de 40 minutes à température ambiante.

À la fin de l’incubation, laver les lames dans du PBS comme démontré, suivi d’un traitement avec du Sudan Black à 0,3 % dans de l’éthanol à 70 % pour éteindre toute autofluorescence potentielle induite par le formol. Après 30 minutes, lavez les lames à l’eau du robinet pour éliminer tout précipité et immergez-les dans du PBS pendant 10 minutes pour éviter toute formation supplémentaire de précipité noir du Soudan.

À la fin de l’incubation, montez les lames sur des lamelles confocales en verre avec des gouttes de 360 microlitres de solution de montage complétée par du DAPI et scellez les lamelles avec du vernis à ongles. Laissez les lames durcir pendant 24 heures à température ambiante. Stockez-les à 4 degrés Celsius à l’abri de la lumière jusqu’à l’imagerie par microscopie confocale à balayage laser selon les protocoles standards.