Isolement des cellules musculaires lisses du détrusor : une procédure de digestion enzymatique pour obtenir des cellules DSM à partir d’échantillons de vessie urinaire humaine

Les cellules du muscle lisse détrusor, ou DSM, présentes dans la paroi de la vessie constituent l’unité fonctionnelle primaire de la vessie. Ces cellules se détendent pour faciliter le stockage de l’urine dans la vessie et se contractent pour libérer l’urine.

Pour isoler les cellules du DSM, commencez par prélever un échantillon de vessie urinaire humaine prélevé. Lavez l’échantillon pour éliminer toute trace de sang et de débris. Par la suite, fixez le tissu avec sa surface muqueuse vers le haut. Excise la graisse, les vaisseaux sanguins et la couche muqueuse pour exposer la couche musculaire détrusor sous-jacente. Ensuite, coupez le tissu sans muqueuse en petits fragments.

Traitez les fragments de tissu avec un cocktail de digestion contenant de la papaïne et incubez. La papaïne, une enzyme protéolytique, favorise la digestion des protéines de la matrice extracellulaire qui maintiennent les cellules ensemble et initie le relâchement des cellules de la matrice. Maintenant, retirez le surnageant contenant de la papaïne.

Ajouter une suspension d’enzymes de collagénase aux fragments de tissu et incuber à température physiologique. La collagénase décompose la matrice extracellulaire et facilite la dissociation des cellules du DSM. L’incubation à température physiologique aide à préserver l’intégrité des cellules du DSM. Jetez le surnageant contenant de la collagénase.

Lavez les fragments de tissu avec un tampon glacé pour éliminer les enzymes résiduelles. Ensuite, suspendez-les à nouveau dans la mémoire tampon. Triturez doucement les fragments de tissu traités aux enzymes pour assurer la dissociation complète de toutes les cellules non libérées et obtenez une suspension unicellulaire de cellules DSM. Stockez les cellules DSM à basse température jusqu’à ce qu’elles soient utilisées ultérieurement.

Commencez par examiner l’échantillon de vessie de toute l’épaisseur. Épinglez l’échantillon, muqueuse vers le haut et séreuse vers le bas, dans une boîte ronde de 150 millimètres recouverte d’énantiomère de silicone remplie de DS glacée, et retirez soigneusement toute la muqueuse par dissection nette.

Découpez plusieurs morceaux de muscle lisse détrusor sans muqueuse ou DSM. Placez 3 à 6 morceaux de DSM dans un tube avec 1 à 2 millilitres de DS préchauffé contenant de la papaïne et du dithiothréitol ou du DS-P. Incuber-les à 37 degrés Celsius pendant 30 à 45 minutes, en prenant soin de secouer le tube toutes les 10 à 15 minutes.

Après l’incubation, retirez le DS-P du tube et lavez brièvement les morceaux DSM avec du DS glacé. Transférez le DS avec les morceaux DSM dans un nouveau tube et retirez le DSM en laissant les morceaux DSM au fond du tube. Ajoutez 1 à 2 millilitres de DS contenant de la collagénase de type II ou DS-C dans le tube et incubez à 37 degrés Celsius en secouant de temps en temps.

Jetez le DS-C et lavez les morceaux de DSM traités aux enzymes 5 à 10 fois avec du DS glacé. Après le dernier lavage, laissez le DS à l’intérieur du tube et triturez doucement les morceaux avec une pipette Pasteur polie au feu pour libérer les cellules DSM individuelles.