Isolement des exosomes : une technique d’ultracentrifugation basée sur la densité utilisant un coussin de saccharose pour séparer les exosomes des milieux conditionnés des cellules en culture

Les exosomes - des vésicules membranaires de taille nanométrique qui portent des biomolécules fonctionnelles - sont activement sécrétés par la plupart des types de cellules et peuvent être isolés à partir de surnageants de culture cellulaire in vitro. Pour isoler les exosomes, il faut d’abord récolter le milieu surnageant ou conditionné à partir d’une culture cellulaire d’intérêt. Le milieu conditionné contiendrait des exosomes, des protéines, des débris cellulaires et des vésicules.

Centrifuger le média pour granuler les débris cellulaires. Récupérez le surnageant contenant des exosomes et filtrez-le à travers des crépines cellulaires pour éliminer les plus grosses vésicules. Transférez un volume spécifique du média filtré dans un tube frais. Ensuite, mélangez des concentrations appropriées de saccharose et d’oxyde de deutérium pour préparer un coussin de saccharose - un gradient discontinu de saccharose.

Ajouter un volume spécifique de la solution de coussin de saccharose dans le tube contenant le milieu ; la solution forme une couche distincte au fond. Maintenant, centrifugez le tube à grande vitesse. Le coussin de saccharose facilite la migration des exosomes du milieu vers la solution de saccharose tout en maintenant l’intégrité des exosomes. Les contaminants protéiques à haute densité occupent l’interface entre la solution de saccharose et le milieu.

Transférez avec précaution la fraction majeure de la couche de saccharose contenant des exosomes dans un tube frais avec un tampon approprié. Centrifuger à grande vitesse pour obtenir une pastille d’exosomes purifiés. Jetez le surnageant contenant du saccharose ainsi que tous les contaminants protéiques. Remettre la pastille d’exosome en suspension dans le tampon et la stocker à basse température jusqu’à ce qu’elle soit utilisée à nouveau.

Pour pré-dégager le milieu conditionné collecté, centrifugez-le à 500 x g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius. Transférez le surnageant dans un nouveau tube et jetez la pastille. Après avoir répété cette étape de centrifugation avec le surnageant récupéré, récupérez à nouveau le surnageant et jetez la pastille.

Ensuite, centrifugez le surnageant récupéré à 2 000 x g pendant 15 minutes et 4 degrés Celsius. Conservez le surnageant et jetez la pastille. Filtrez le surnageant une fois à travers un filtre de 0,22 micromètre fixé à une seringue de 20 millilitres dans un tube de centrifugation frais.

Pendant ce temps, pour préparer une solution de saccharose à 25 % dans de l’oxyde de deutérium, pesez avec précision 1,9 gramme de saccharose dans un tube universel. Ensuite, ajoutez de l’oxyde de deutérium jusqu’à ce que le poids atteigne 7,6 grammes. Ensuite, remplissez un tube d’ultracentrifugation avec 22,5 millilitres de milieu conditionné pré-autorisé.

Placez une pipette en verre dans le tube. Ajoutez 3 millilitres de solution de saccharose à travers la pipette de sorte que la solution forme une couche distincte sous le milieu conditionné. Placez avec précaution le tube contenant une solution de saccharose conditionnée en couches dans le godet d’un rotor pivotant.

Fixez le godet dans le rotor. Placez le rotor dans l’ultracentrifugeuse et faites-le tourner de 100 000 x g à 4 degrés Celsius pendant 1,5 heure. Prélevez 2 millilitres de la couche de saccharose du tube, 1 millilitre à la fois, à l’aide d’une pipette P1000 dont la pointe est attachée à un embout de 10 microlitres et ajoutez-la dans un flacon ultracentrifuge contenant 20 millilitres de PBS filtré pour le lavage.

Placez le tube dans un rotor à angle fixe et centrifugez-le à 100 000 x g à 4 degrés Celsius pendant 1,5 heure. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres, on retire soigneusement le surnageant. Remettez en suspension le granulé avec 400 microlitres de PBS filtré.