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0 vues • 3:04 min • April 30th, 2023
Les exosomes - des vésicules membranaires de taille nanométrique dérivées de cellules - présentent un potentiel en tant que véhicules d’administration thérapeutique pour les petits ARN interférents double brin ou siRNA.
Après sa libération dans le cytoplasme de la cellule cible, le siRNA se lie au complexe de silençage induit par l’ARN. Le complexe activé reconnaît et se lie ensuite à un ARNm spécifique, régulant négativement son expression et médiant le silençage génique.
Pour encapsuler des siRNA dans des exosomes, il faut d’abord refroidir une cuvette d’électroporation sur de la glace. Ensuite, mélangez des exosomes et des siRNA spécifiques dans un tube dans le rapport souhaité à l’aide d’un tampon d’électroporation approprié. Maintenant, transférez ce mélange dans la cuvette pré-refroidie.
Fermez la cuvette et placez-la dans le support de cuvette de l’électroporateur. Faites tourner la roue tournante pour vous assurer que la cuvette entre en contact avec les électrodes d’électroporation. Maintenant, exécutez le programme d’électroporation sélectionné.
Lors de l’électroporation, les impulsions électriques perturbent la bicouche phospholipidique des exosomes en suspension dans le tampon conducteur. Cela se traduit par la formation de pores transitoires dans la membrane de l’exosome, favorisant la diffusion de l’ARNi dans la vésicule. Le tampon aide à prévenir l’agrégation des siRNA.
Une fois l’électroporation terminée, les pores se referment, piégeant l’ARNi à l’intérieur. Enfin, retirez la cuvette de l’électroporateur et transférez le mélange dans un tube frais. Stockez les exosomes encapsulés dans des siRNA à basse température jusqu’à ce qu’ils soient utilisés ultérieurement.
Avant de commencer l’électroporation, pré-refroidissez la cuvette d’électroporation sur de la glace pendant 30 minutes. Mélangez 7 microgrammes d’exosomes avec 0,33 microgramme d’ARNi dans le tube de microcentrifugation. Ajoutez un tampon d’acide citrique pour atteindre le volume de 150 microlitres. Ajouter le mélange exosome-siRNA dans la cuvette d’électroporation à l’aide d’une pipette en plastique et boucher la cuvette.
Placez la cuvette dans le bon sens dans le support de cuvette de l’électroporateur et tournez la roue tournante de l’électroporateur de 180 degrés dans le sens des aiguilles d’une montre. Sélectionnez le programme souhaité et appuyez sur le bouton Start pour démarrer l’électroporation. L’écran indiquera une impulsion réussie.
Ensuite, tournez la roue de 180 degrés dans le sens inverse des aiguilles d’une montre et retirez la cuvette. À l’aide d’une pipette en plastique, retirez l’échantillon de la cuvette dans un nouveau tube de microcentrifugation. Conservez le tube sur de la glace ou dans un réfrigérateur avant de poursuivre le traitement s’il n’est pas utilisé immédiatement.