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Pour isoler les cellules épithéliales tubulaires rénales ou TEC, commencez par prélever un rein de souris fraîchement isolé dans une boîte de Pétri. Retirez la capsule rénale - la fine couche externe entourant le rein - et retirez la moelle ou la partie la plus interne du rein, laissant le cortex contenant le tubule et les cellules épithéliales tubulaires.
Hachez les parties restantes des reins en petits morceaux et incubez-les dans un tampon de digestion chaud contenant l’enzyme collagénase. La collagénase décompose la protéine de collagène qui maintient les tissus rénaux ensemble, libérant les tubules rénaux et les cellules rénales en suspension.
Filtrez la suspension pour éliminer les tissus rénaux non digérés. Ensuite, ajoutez un milieu de culture pré-refroidi au filtrat. La température plus basse neutralise la collagénase et arrête la digestion des tissus. Centrifuger le filtrat à basse vitesse pour permettre aux tubules et aux cellules tubulaires plus denses de se déposer tandis que les autres types de cellules et les impuretés restent en suspension.
Retirez cette fraction surnageante indésirable et ajoutez du milieu de culture pour remettre la pastille en suspension. Grainez la suspension dans une boîte de culture enrobée de collagène et incubez. Les cellules tubulaires libres se fixent fermement au collagène tandis que les tubules restent en suspension. Sous-culture pour retirer les tubules non attachés et obtenir la culture primaire de cellules épithéliales tubulaires.
Pour traiter les reins prélevés, retirez d’abord les capsules rénales et la moelle. Ensuite, hachez les deux rognons en petits morceaux et incubez-les dans 10 millilitres d’un tampon de digestion dans un four à 37 degrés Celsius avec une rotation douce pendant 5 minutes.
Après la digestion, retirez tous les tissus non digérés en passant le tampon à travers un filtre de 70 microns. Après avoir recueilli le tissu digéré, ajoutez 10 millilitres de milieu de culture pour arrêter la digestion. Ensuite, centrifugez la suspension de tissu filtré à 50 x g pendant 5 minutes pour granuler les cellules tubulaires. Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube, ajoutez 5 millilitres de milieu de culture et répétez la centrifugation pour recueillir les cellules tubulaires restantes.
Maintenant, mettez la première pastille en suspension dans 20 millilitres de milieu de culture et centrifugez-la à 50 x g pendant 5 minutes pour purifier davantage les cellules collectées. Disposer du surnageant. Ensuite, mettez les deux granulés en suspension dans 10 millilitres de milieu de culture. Ensuite, comptez les cellules vivantes à l’aide de la coloration au bleu trypan. Ensuite, ensemencez jusqu’à 10 millions de cellules dans une boîte recouverte de collagène de 60 millimètres et laissez les cellules tubulaires se fixer pendant la nuit.