Micro-injection intraveineuse de néphrotoxines dans l’embryon de poisson-zèbre : une technique pour administrer des agents néphrotoxiques dans la circulation sanguine de l’embryon de poisson-zèbre

La micro-injection intraveineuse facilite l’administration de molécules d’intérêt dans la circulation sanguine d’un animal receveur. Pour administrer des néphrotoxines dans un embryon de poisson-zèbre, préparez d’abord une concentration appropriée de la solution de néphrotoxine souhaitée.

À l’aide d’une fine pointe de chargement de gel, chargez cette solution de néphrotoxine dans une aiguille de micro-injection avec une pointe angulaire aiguisée. Suspendez l’aiguille verticalement pour permettre à la solution de néphrotoxine de remplir la pointe de l’aiguille par gravité. Fixez maintenant l’aiguille de micro-injection chargée dans le support d’un micromanipulateur.

Par la suite, transférez un embryon de poisson-zèbre anesthésié dans le moule de micro-injection préfabriqué. Alignez l’embryon dans le moule avec sa tête orientée à l’intérieur du puits et la queue hors du puits, améliorant ainsi l’accessibilité à la queue pour la micro-injection. Ensuite, positionnez précisément la pointe de l’aiguille près de l’embryon.

Injectez la solution de néphrotoxine dans la veine de la queue de l’embryon. Les agents néphrotoxiques injectés se propagent dans la circulation et atteignent des organes éloignés comme les reins. Rétractez doucement l’aiguille. Transférez l’embryon dans une boîte fraîche contenant un milieu embryonnaire et laissez-le se rétablir. Incuber l’embryon pendant une durée déterminée.

Dans les heures qui suivent l’injection, les néphrotoxines s’accumulent dans le rein et causent des dommages, entraînant un déclin de la fonction rénale.

Le jour de l’injection, préparer la solution de néphrotoxine souhaitée avec le contrôle approprié du véhicule. Vortex ou mélangez-le doucement. Ensuite, vérifiez les côtés du tube et le haut de la colonne d’eau pour vous assurer que les médicaments sont dissous dans la solution.

Chargez une aiguille de micro-injection coupée avec 2 à 3 microlitres de néphrotoxine en enfilant une fine pointe de chargement de gel à l’arrière de l’aiguille et suspendez l’aiguille verticalement avec un morceau de ruban adhésif pour permettre à la solution de remplir la pointe de l’aiguille coupée par gravité.

Une fois que la pointe de l’aiguille est pleine, fixez l’aiguille chargée dans le micromanipulateur. Testez le volume de micro-injection en plaçant une goutte d’huile minérale sur une lame micrométrique et injectez-la dans l’huile pour évaluer la taille des gouttelettes.

Ensuite, retirez la boîte d’embryons de l’incubateur et anesthésiez-les en ajoutant 5 millilitres de tricaïne à 0,2 % dans la boîte à embryons. Ensuite, transférez les embryons dans le moule d’injection à l’aide d’une pipette de transfert. Manœuvrez chaque embryon dans un puits différent du moule, en plaçant la tête dans la zone la plus profonde du puits de sorte que le tronc repose le long de la dépression et que la queue en sorte.

Maintenant, insérez l’aiguille remplie dans le micromanipulateur et placez la pointe de l’aiguille à côté d’un embryon. Insérez doucement l’aiguille dans la veine de la queue pour la microinjection.

L’étape la plus critique de la procédure est la micro-injection. Pour assurer le succès, l’aiguille doit être coupée à un angle aigu et doit être déplacée avec précaution en position à côté de l’embryon.

Si l’injection réussit, vous devriez voir le liquide entrer dans la circulation. L’injection concomitante du néphrotoxique avec du dextran conjugué par fluorescence permettrait au chercheur de vérifier l’efficacité de l’injection après la procédure. Ensuite, retirez délicatement l’aiguille de l’embryon.

Transférez l’embryon dans une boîte propre et rincez-le pour l’enlever avec de l’E3/PTU frais. Ensuite, incubez l’embryon jusqu’au point temporel souhaité pour évaluer la morphologie, qui peut être documentée par photographie dans des supports de montage en méthylcellulose, ou par un processus d’analyse expérimentale si vous le souhaitez.

Notez que la récupération des embryons doit être évaluée toutes les 12 à 24 heures après l’injection pour déterminer le pourcentage d’individus atteints d’œdème, ce qui indique généralement une lésion rénale.