Aspiration de liquide à partir de glomérules de souris : une méthode pour aspirer du liquide glomérulaire de souris à l’aide de la microponction médiée par deux photons

Dans le rein, le glomérule - un faisceau de petits vaisseaux sanguins enfermés dans la capsule de Bowman - initie la filtration du sang et expulse le liquide résiduel dans l’espace environnant de Bowman. L’étude du contenu du liquide glomérulaire aide à comprendre la physiologie rénale.

Pour aspirer le liquide glomérulaire, préparez une souris anesthésiée avec son rein extériorisé chirurgicalement. Maintenant, injectez un colorant fluorescent-dextran dans les vaisseaux sanguins derrière l’orbite oculaire de la souris. Les molécules de dextran fluorescent se déplacent dans la circulation sanguine et atteignent les reins.

En raison du poids moléculaire élevé du dextran, le colorant fluorescent est retenu dans le glomérule, ce qui lui confère une couleur verte. Sous un microscope à deux photons, qui permet de visualiser des structures profondément ancrées, localisez un glomérule approprié pour obtenir un accès adéquat au liquide glomérulaire.

Ensuite, alignez l’embout d’une micropipette recouverte de nanoparticules fluorescentes rouges avec l’axe latéral du rein. À l’aide d’un micromanipulateur, avancez la pointe de la pipette pour qu’elle pénètre dans le rein. Lorsque l’extrémité atteint le glomérule cible, réglez le taux d’aspiration souhaité pour aspirer le liquide glomérulaire de l’espace de Bowman.

L’absence de fluorescence verte à l’intérieur de la pointe rouge de la pipette indique l’absence de saignement et confirme la réussite de l’aspiration du liquide glomérulaire. Ensuite, rétractez la pipette et stockez le liquide dans un tampon approprié pour une analyse plus approfondie.

Après avoir confirmé une absence de réponse au pincement des orteils, appliquez une pommade sur les yeux et utilisez du ruban adhésif pour immobiliser les extrémités d’une souris adulte de 20 à 25 grammes. Utilisez une crème dépilatoire pour enlever tous les poils du côté gauche de l’animal et utilisez la rate pour localiser le rein gauche à travers la peau des côtés dorsal et caudal de la rate.

Faites une incision de 0,5 centimètre dans la peau, suivie d’une incision plus petite dans le péritoine, juste assez grande pour que le rein puisse être poussé à travers. Extrudez le rein avec une légère pression et placez une forme de stabilisateur rénal polysiloxane autour du tissu. Alignez le rein avec l’espaceur de sorte que la surface la plus latérale du rein s’étende au-delà du stabilisateur d’environ 1 millimètre et fixez le rein à la forme avec un adhésif cyanoacrylate. Collez une plaque de tête sur la forme du stabilisateur et montez la plaque de tête sur des barres de montage sur la plaque de base.

Ensuite, remplissez le puits dans le support en polysiloxane avec une solution d’agarose à 1 % et maintenez une lamelle de recouvrement de 10 millimètres sur le dessus du coffrage jusqu’à ce que l’agarose soit ferme. Scellez la lamelle sur la plaque de tête avec de la colle et créez un anneau autour de la lamelle avec du ciment dentaire. Ensuite, injectez 100 à 150 microlitres de FITC-dextran par voie rétro-orbitale et déplacez rapidement la souris et la plaque de fixation vers la platine du microscope à deux photons.

Après avoir effectué la mise au point manuelle sur la surface du rein, passez en mode à deux photons sans balayage et explorez la fenêtre d’imagerie pour localiser un glomérule cible situé à plus de 30 micromètres sous la lamelle et à moins de 400 micromètres de la capsule rénale latérale. Enregistrez la distance latérale et verticale par rapport au glomérule cible. Ensuite, enregistrez les coordonnées des stades x, y et z du glomérule, et enfin, élevez le point focal de l’objectif d’environ 1 millimètre dans la colonne d’eau sans modifier les coordonnées des stades x et y.

Enfoncez la pointe de la pipette dans la colonne d’eau et activez l’excitation DAPI. Déplacez la pipette dans les dimensions X et Y jusqu’au point de fluorescence maximale de la pointe. Ce sera le centre de l’objectif. Changez le réglage d’excitation sur la protéine fluorescente rouge et visualisez la pipette avec l’oculaire pour permettre un centrage précis dans la vue oculaire.

Revenez à deux photons pour trouver la pipette sous la vue à deux photons en direct et placez la pointe précisément au centre de l’image. Il s’agit du poste d’inscription. Ensuite, enregistrez une image de la pipette et enregistrez les coordonnées de l’étage et du contrôleur de la micropipette. Retirez la pipette de la colonne d’eau sur l’axe des x sans déplacer les axes y et z, et déplacez la pipette Z jusqu’à la coordonnée Z du glomérule cible et le bord du rein.

Notez l’étape X et calculez la pipette de bord rénal X en utilisant le décalage par rapport à l’étape de repérage, X. Augmentez l’étape X pour déplacer l’étape vers la pipette jusqu’à ce que le bord du rein soit loin à gauche de l’écran tout en restant visible. Avancez rapidement la pipette à environ 100 micromètres de la pipette de bord rénal X comme vous venez de le calculer. Augmentez le gain rouge et commencez à avancer lentement la pointe de la pipette vers le bord du rein sous l’imagerie à deux photons en direct tout en surveillant l’histogramme des pixels rouges.

Dirigez lentement la pipette dans l’axe des x jusqu’à la pipette cible du glomérule X, en gardant un œil sur l’étage X. En atteignant le glomérule, documentez la position avec une pile Z. Avec la pipette en position, réglez la micropompe pour injecter 100 nanolitres de perfluorodécaline en 2 minutes afin d’assurer la perméabilité de la pipette et de réduire les facteurs de confusion dus au bouchage de la pipette lors de l’entrée. Après 4 à 6 minutes de filtration, réglez la micropompe pour aspirer jusqu’à 300 nanolitres à un débit allant jusqu’à 50 nanolitres par minute.