Injection de microbulles dans des embryons de souris isolés : une technique pour délivrer des agents de contraste à microbulles dans le système vasculaire d’embryons murins vivants

Pour l’administration de microbulles, commencez par une suspension uniforme de microbulles à enveloppe lipidique ciblées par des cellules endothéliales comprenant un noyau gazeux dans une seringue reliée à la tubulure.

Chargez cet ensemble dans un pousse-seringue et fixez une aiguille en verre à la tubulure. Maintenant, transférez un embryon de souris réfrigéré exprimant des récepteurs spécifiques des cellules endothéliales dans une boîte placée sur la scène d’un stéréoscope.

Extériorisez doucement l’embryon du sac vitellin et de la membrane amniotique. Fixez le sac et les bords placentaires. Rincez l’embryon avec un tampon chaud pour rétablir sa circulation sanguine. Couvrez l’embryon avec du gel à ultrasons préchauffé pour une transmission optimale des ondes ultrasonores. Compléter avec un tampon pour maintenir ses conditions physiologiques.

Injectez soigneusement la suspension de microbulles au débit souhaité dans une veine appropriée à la surface de la membrane fœtale du disque placentaire à l’aide de la pompe à seringue. Les microbulles injectées voyagent dans la circulation et se lient aux récepteurs spécifiques des cellules endothéliales qui tapissent les vaisseaux sanguins.

Utilisez un transducteur à ultrasons pour transmettre des ondes ultrasonores à haute fréquence à l’embryon. Les noyaux de gaz hautement compressibles des microbulles les font osciller de manière non linéaire, diffusant des ondes ultrasonores avec des fréquences différentes des ondes incidentes. Ces signaux et les signaux linéaires du tissu retournent au transducteur.

Le transducteur les relaie à un système d’imagerie qui différencie les signaux diffusés par les microbulles des signaux tissulaires, produisant des images échographiques avec contraste amélioré des vaisseaux sanguins embryonnaires.

Pipeter le volume nécessaire de solution mère de microbulles et l’ajouter à l’aliquote de solution saline. Mélangez en remuant doucement avec l’extrémité de la pipette. Ensuite, à l’aide d’une aiguille de calibre 21, aspirez la solution de microbulles diluée dans une seringue propre. Après avoir retiré l’aiguille, éliminez toutes les bulles d’air de la seringue et fixez le luer et la tubulure. Poussez lentement la solution jusqu’à l’extrémité du tube, en veillant à ne pas générer de bulles d’air.

Enfin, insérez la seringue dans un ensemble de pompe à perfusion pour seringue pour distribuer les microbulles à un débit de 20 microlitres par minute pour un volume total de 20 microlitres. Fixez une aiguille de verre tirée à l’extrémité du tube. Déplacez la pompe près de l’étape d’injection. À l’aide d’une cuillère perforée, sélectionnez et retirez au hasard un embryon du plat de milieu réfrigéré. Placez l’embryon dans une boîte de dissection située sur la platine d’échographie sous le stéréoscope.

Ensuite, localisez le côté de l’embryon qui semble le moins vascularisé. Voici une zone de faible vascularisation, généralement adjacente à la région de la tête. Ensuite, utilisez des pinces fines pour couper ou déchirer juste assez de sac vitellin et de membranes amniotiques pour pouvoir retirer l’embryon de l’intérieur, mais pas plus. Ensuite, manœuvrez doucement le sac autour de l’embryon. Ensuite, positionnez l’embryon sur le côté avec le placenta et les vaisseaux ombilicaux devant.

Stabilisez le plat de dissection à l’aide de petits morceaux de pâte à modeler. À l’aide de quatre épingles à insectes, épinglez le sac vitellin et les bords du placenta, en évitant les gros vaisseaux. À l’aide d’une seringue contenant du PBS préchauffé à 45 degrés Celsius, lavez l’embryon jusqu’à ce que l’on puisse voir du sang couler dans l’embryon. L’artère ombilicale est identifiée par le sang pulsatile rouge vif. La veine ombilicale et son réseau vasculaire associé ont du sang plus foncé et recouvrent généralement ceux de l’artère ombilicale du côté placentaire.

À ce stade, positionnez le plat de manière à ce que l’injection puisse se faire confortablement. Une fois que l’embryon a été ranimé, couvrez-le, mais pas le placenta, avec du gel à ultrasons préchauffé. À l’aide d’une pince fine, retirez délicatement les bulles d’air autour de l’embryon et remplissez le plat avec du PBS préchauffé. Tout au long de la procédure, gardez un œil sur le niveau de solution dans les seringues PBS et gel et ajoutez des seringues de secours dans le bécher chauffant au besoin.

Ensuite, montez l’aiguille en verre sur une grosse boule de pâte à modeler sur le bord du plat de dissection et insérez l’extrémité de l’aiguille dans le PBS. Choisissez une veine sur la surface choriale du disque placentaire aussi loin que possible de la branche principale. Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper la pointe de l’aiguille en fonction de la taille du récipient, en coupant la pointe à un léger angle. Utilisez le bord des ciseaux à ressort pour enlever les bords déchiquetés du verre.

Maintenant, à l’aide de la pompe à seringue, injectez lentement la solution de microbulles à 20 microlitres par minute dans l’aiguille en verre jusqu’à ce que tout l’air soit expulsé de la pointe de l’aiguille et que l’on puisse voir les microbulles s’écouler librement dans le PBS. Arrêtez la pompe et réinitialisez-la pour un volume d’injection de 20 microlitres. Ne laissez pas l’air pénétrer dans l’aiguille d’injection afin d’éviter d’injecter de l’air dans le système vasculaire de l’embryon.

Insérez doucement l’embout de l’aiguille en verre dans la veine sélectionnée du placenta et assurez-vous qu’il est immobile. Écartez la tête du stéréoscope et positionnez le transducteur à ultrasons de manière à ce que l’embryon soit situé uniformément entre les foyers à 6 et 10 millimètres. Ensuite, lancez l’imagerie et commencez l’injection en bolus des microbulles. Au bout d’une minute, lorsque l’injection est terminée, démarrez le minuteur de l’étape d’acquisition des données.