Isolement des bactéries commensales conjonctivales à base d’écouvillons : une technique pour isoler les bactéries commensales de la conjonctive d’un modèle murin

La conjonctive de l’œil abrite des bactéries commensales. Cette microflore indigène protège l’œil contre les infections en activant les cellules immunitaires pour attaquer tous les microbes nocifs qui pénètrent dans les muqueuses oculaires.

Pour isoler les bactéries commensales, placez une souris anesthésiée en position latérale. Prélever un écouvillon oculaire stérile trempé dans un milieu approprié. Insérez l’embout humide dans la région conjonctivale médiale de l’œil gauche. Abaissez le globe oculaire et déplacez l’écouvillon d’avant en arrière le long de la conjonctive pour recueillir une population commensale diversifiée.

Retirez l’écouvillon et mélangez-le dans un tube contenant un média d’enrichissement microbien. Cette étape libère les bactéries piégées du maillage de coton de l’écouvillon dans le média. Jetez l’écouvillon et incubez le tube pour faciliter le début de la croissance bactérienne.

Versez quelques gouttes de l’écouvillon oculaire inoculé dans un milieu enrichi sur une plaque de gélose au sang selon le schéma souhaité et incuberez. Les peptones de caséine et de soja présents dans le milieu fournissent l’azote nécessaire à la synthèse des peptides tandis que le chlorure de sodium maintient l’équilibre osmotique.

Les bactéries commensales possèdent des enzymes hémolysine qui digèrent l’hémoglobine présente dans les milieux sanguins. Cela produit un motif caractéristique sur la plaque de gélose, provoquant la prolifération de différentes bactéries en colonies morphologiquement distinctes. Comptez le nombre de colonies pour déterminer leur abondance relative dans la conjonctive.

Assurez-vous que la souris est correctement anesthésiée en pressant un coussinet de patte arrière. Ne continuez que s’il n’y a pas de mouvement. Attribuez une main à la manipulation des souris anesthésiées et l’autre main à la manipulation de l’écouvillon oculaire et de la culture. Retirez la souris de la cage et placez-la sur le dessus de la surface de travail positionnée sur le côté, l’œil gauche exposé. Vaporisez les mains gantées d’isopropanol et séchez-les avec une serviette en papier.

Débouchez un tube de microcentrifugation BHI étiqueté à l’aide de la main dédiée à la manipulation des supports et remettez-le dans le rack. Trempez l’extrémité de l’écouvillon oculaire enduite de coton dans le BHI. Ensuite, retirez l’écouvillon du tube tout en faisant tourner l’embout deux fois contre le tube intérieur pour éliminer l’excès de liquide et l’éliminer.

Avec la main de manipulation de la souris, tenez doucement la souris par la peau du cou. De l’autre main, placez l’extrémité de l’écouvillon oculaire contre la région conjonctivale médiale de l’œil gauche. Appuyez légèrement sur le globe oculaire et déplacez l’écouvillon dans un mouvement de lavage de vitre entre la paupière inférieure et l’œil 10 fois, en maintenant une pression constante. Sans toucher la fourrure, retirez délicatement l’extrémité de l’écouvillon perpendiculairement à l’endroit où il a été inséré. Placez l’écouvillon côté coton vers le bas directement dans un tube de microcentrifugation étiqueté avec un média BHI.

Appliquez un collyre sur l’œil écouvillonné. Si vous le souhaitez, procurez-vous des écouvillons de peau ou de fourrure pour les échantillons de contrôle, en stérilisant les gants de manière appropriée entre chaque écouvillon. Lorsque vous avez terminé, remettez la souris dans la cage. Laissez l’écouvillon reposer pendant 10 à 15 minutes sur de la glace. Ensuite, stérilisez les mains gantées et retirez l’écouvillon tout en mélangeant l’embout dans le milieu pendant 10 rotations. Retirez l’écouvillon en faisant tourner l’embout contre la paroi intérieure du tube pendant cinq rotations et jetez-le dans un récipient à risque biologique. Répétez le processus pour chaque souris.

Enrichissez l’échantillon en incubant les tubes de manière statique pendant 1 heure à 37 degrés Celsius. Pendant l’incubation, étiquetez une plaque TSA à température ambiante par écouvillon œil de souris ou écouvillon témoin et divisez-la en deux. Retirez les échantillons enrichis de l’incubateur et placez-les sur de la glace. Vortex brièvement les échantillons à mélanger. Ensuite, aliquote 10 microlitres de l’échantillon sur la plaque TSA et inclinez la plaque pour former une bande. Répétez cette opération deux fois.

De l’autre côté de la ligne de démarcation de la plaque, créez 10 points de 10 microlitres d’échantillon chacun. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 18 heures, 2 jours et 4 jours dans une chambre propre qui empêche les plaques de gélose de sécher. Comptez les colonies dans les bandes. Notez la morphologie et calculez les unités formant des colonies par écouvillon pour des isolats morphologiquement similaires.