Isolement des cellules interstitielles valvulaires de souris : une méthode enzymatique pour isoler et cultiver des CIV à partir de la valve aortique de souris

La valve aortique du cœur est une structure à trois feuillets composée des cellules interstitielles de la valve interne, ou VIC, réparties dans toute la matrice extracellulaire dense et des cellules endothéliales valvulaires sus-jacentes, ou VEC.

Pour isoler les CIV, préparez d’abord une souris euthanasiée en position couchée. Par l’incision médiane de l’abdomen et de la poitrine, exposez le cœur. Faites une petite entaille entre l’oreillette gauche et le ventricule, suivie d’une perfusion saline pour drainer le sang. Sectionnez l’aorte ascendante au niveau de l’arc aortique et prélevez le cœur.

Transectez et jetez les deux tiers distaux des ventricules avant de disséquer longitudinalement la partie restante du cœur pour révéler les feuillets de la valve aortique en forme de « U ». Exciser les feuillets et rincer avec un tampon réfrigéré pour éliminer le sang.

Par la suite, traitez les feuillets avec une solution de collagénase faiblement concentrée et incuber. À de faibles concentrations, la collagénase - une enzyme protéolytique - ne décompose que partiellement la matrice extracellulaire, délogeant les VEC de surface des feuillets.

Centrifugez et remplacez le surnageant contenant l’enzyme par un tampon, en transférant la pastille remise en suspension dans une boîte de Pétri. Récupérez les feuillets et traitez-les avec une solution de collagénase hautement concentrée pour une seconde digestion. Lors de l’incubation, la collagénase dégrade davantage la matrice extracellulaire, libérant des CIV en solution.

Centrifuger pour granuler les VIC et les remettre en suspension dans un milieu approprié. Enfin, ensemencez un faible volume de suspension cellulaire sur une plaque multipuits pour faciliter l’adhérence des CIV au fond du puits. Incuber pour permettre aux CIV de proliférer.

Avant de commencer l’expérience, nettoyez et stérilisez tous les instruments chirurgicaux et l’espace de travail avec de l’éthanol à 70 % et autoclavez les instruments chirurgicaux pendant 30 minutes. Lorsque la configuration initiale est prête, commencez par nettoyer la poitrine et la région de l’abdomen d’une souris euthanasiée de 8 semaines à l’aide d’éthanol.

À l’aide de ciseaux, ouvrez l’abdomen et la poitrine de la souris. Ensuite, coupez entre l’oreillette gauche et le ventricule gauche avec de petits ciseaux chirurgicaux. Retirez le sang du cœur en perfusant 10 millilitres de PBS froid et coupez le cœur en gardant 3 millimètres de l’aorte ascendante. Au stéréomicroscope, disséquez la valve aortique en coupant le cœur horizontalement au milieu des ventricules et en coupant le ventricule gauche vers l’aorte. Ensuite, disséquez soigneusement la valve aortique. Regroupez les vannes dans une petite boîte de culture tissulaire de 35 millimètres.

Lavez les valves isolées dans une boîte de culture cellulaire de 75 millilitres avec 5 millilitres de HEPES froids de 10 millimolaires fraîchement préparés complétés par des antibiotiques et incubez dans 5 millilitres de collagénase de type I pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius en secouant continuellement. Après l’incubation, centrifugez le tube pendant 5 minutes à 150 x g et lavez une fois le granulé avec 2 millilitres de HEPES millimolaires avec vortex à grande vitesse pendant 30 secondes.

Récupérez la suspension résultante du tube dans une boîte de culture de 35 millimètres et utilisez une pince à épiler fine pour transférer soigneusement les fragments de tissu dans un tube frais. Ensuite, incubez la pastille dans un tube de 15 millilitres à 5 millilitres de collagénase de type I à 37 degrés Celsius sous agitation continue pendant 35 minutes. Séparez les cellules en les remettant en suspension à l’aide d’une pipette de 1 millilitre et centrifugez-les à 150 x g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius. Nettoyez les cellules deux fois en remettant en suspension la pastille séparée dans 2 millilitres de DMEM complet et en centrifugeant à 150 x g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius.

Pour le placage, remettez la pastille en suspension dans 1 millilitre de milieu complet et ajoutez-la dans un puits d’une boîte de culture cellulaire de 6 puits dans une quantité minimale de milieu. Gardez les plaques intactes à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Après 3 jours d’incubation, confirmez la croissance plus près des débris tissulaires en observant les cellules au microscope. Une fois que 1 000 cellules sont visibles, retirez soigneusement les débris de tissu à l’aide d’une pince à épiler autoclave et changez de milieu.