Isolement des cellules IPE et RPE : une technique pour obtenir des cellules épithéliales de pigment oculaire à partir d’œil de lapin
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologie
0 vues • 4:17 min • July 8th, 2025
Les cellules épithéliales pigmentaires sont des cellules cuboïdes différenciées en phase terminale reliées par des jonctions serrées. Ces cellules épithéliales qui tapissent l’iris sont les cellules épithéliales pigmentaires de l’iris ou cellules IPE, et celles proches de la rétine sont les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes ou EPR.
Pour extraire ces cellules, prenez un œil de lapin intact. Traitez l’œil avec un désinfectant pour éliminer tous les micro-organismes de la surface de l’œil. Lavez le désinfectant avec une solution tampon. Faites une incision près de l’iris. À l’aide de cette ouverture, faites une coupe circulaire complète le long de la limite de l’iris, divisant l’œil en un segment antérieur contenant l’iris et une partie postérieure comprenant la rétine et l’humeur vitrée.
Prenez le segment antérieur et jetez le cristallin pour accéder à l’iris. Retirez l’iris et placez-le sur une boîte de culture. Par la suite, prenez le segment postérieur et jetez l’humeur vitrée gélatineuse et la rétine du bulbe oculaire.
Traitez l’iris et le bulbe oculaire avec de la trypsine et incuber. La trypsine dégrade la jonction serrée et les protéines de la matrice extracellulaire, initiant la dissociation des cellules épithéliales. Jetez la trypsine et ajoutez un milieu de culture approprié. Grattez doucement la surface de l’iris et du bulbe oculaire pour libérer les cellules épithéliales dans le milieu.
Enfin, ensemencez les cellules IPE et RPE dans des puits séparés. Les cellules sont prêtes pour d’autres analyses en aval.
Après l’euthanasie de l’animal, utilisez des ciseaux incurvés et une pince Colibri pour énucléer les yeux, puis nettoyez le reste des tissus musculaires et de la peau des yeux. Prélevez les yeux dans un tube de 50 millilitres rempli de PBS non stérile et transférez le tube dans la hotte à flux laminaire. Désinfectez-les en les immergeant dans une solution à base d’iode pendant deux minutes, puis transférez les yeux dans un tube de 50 millilitres rempli de PBS stérile.
Placez un œil sur une compresse de gaze stérile et tenez fermement l’œil près du nerf optique, puis coupez près de la limite de l’iris avec un scalpel #11. À l’aide de ciseaux, coupez autour de l’iris, retirez le segment antérieur et placez-le dans une boîte de Pétri en laissant le bulbe avec le vitré, jusqu’à ce que les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes, ou EPR, soient isolées.
Pour isoler les cellules épithéliales pigmentaires de l’iris, ou cellules EPI, retirez le cristallin à l’aide d’une pince fine et retirez délicatement l’iris contenant les cellules EPI. Placez l’iris dans une boîte de Pétri et lavez-la avec du PBS stérile. Ajoutez 500 microlitres de trypsine à 0,25 % et incubez pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Retirez la trypsine, ajoutez 500 microlitres de milieu complet et grattez délicatement l’IPE avec une pipette plate Pasteur polie au feu.
Récupérez la suspension cellulaire et mettez-la dans un tube de 1,5 millilitre. Comptez les cellules à l’aide de la chambre de Neubauer et ensemencez 0,2 million de cellules par puits dans une plaque de 24 puits avec 1 millilitre de milieu complet. Placez l’assiette dans un incubateur et cultivez-la à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.
Pour isoler les cellules EPR, retirez l’humeur vitrée et la rétine du segment postérieur à l’aide d’une pince fine. Mettez les bulbes dans une plaque de 24 puits et ajoutez 500 microlitres de trypsine à 0,25 % par œil, et incubez pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Retirez la trypsine, ajoutez 500 microlitres de milieu complet par globe et grattez délicatement les cellules EPR avec une pipette Pasteur incurvée polie au feu.
Récupérez la suspension cellulaire et mettez-la dans un tube de 1,5 millilitre. Comptez les cellules à l’aide de la chambre de Neubauer et ensemencez les cellules comme décrit précédemment. Placez la plaque dans l’incubateur.
Aperçu
Cet article décrit l'isolement de cellules épithéliales pigmentaires de l'iris (IPE) et de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (RPE) provenant d'yeux de lapin. Le processus implique une dissection minutieuse et un traitement enzymatique afin de dissocier les cellules pour des essais ultérieurs.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Neurosciences
- Ophtalmologie
Contexte
- Les cellules épithéliales pigmentées de l’iris sont cuboïdales et différenciées de manière terminale.
- Ces cellules sont essentielles pour diverses fonctions oculaires.
- L’isolement de ces cellules est indispensable pour la recherche et les applications thérapeutiques.
- Des techniques appropriées sont nécessaires pour maintenir la viabilité et la fonctionnalité cellulaire.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole détaillé pour l'isolement des cellules IPE et RPE.
- Faciliter les tests en aval à des fins de recherche.
- Améliorer la compréhension du comportement cellulaire dans les tissus oculaires.
Méthodes utilisées
- Assainissement et préparation des yeux de lapin.
- Disséction pour séparer les segments antérieur et postérieur.
- Utilisation de la trypsine pour dissocier les cellules épithéliales.
- Comptage cellulaire et semis dans des plaques de culture pour la croissance.
Résultats principaux
- Isolation réussie des cellules IPE et RPE à partir d'yeux de lapin.
- Les cellules étaient viables et adaptées à des essais supplémentaires.
- Le protocole a démontré une reproductibilité et une efficacité élevées.
- La morphologie cellulaire a été préservée après l'isolement.
Conclusions
- La méthode décrite est efficace pour isoler les cellules IPE et RPE.
- Ces cellules peuvent être utilisées pour diverses applications expérimentales.
- De futures études pourront s'appuyer sur ce protocole pour des recherches avancées.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'isolement des cellules de l'épithélium pigmentaire oculaire permet une détection mécanistique des risques lors de la validation de cibles thérapeutiques dans les maladies rétiniennes, en fournissant un système pertinent pour des tests fonctionnels. Cette technique soutient le développement d'essais et le criblage phénotypique de stratégies thérapeutiques ciblant les maladies dégénératives de la rétine. La méthode améliore la fiabilité prédictive des modèles précliniques en fournissant des cellules primaires de type humain pour les études d'engagement des cibles.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques dans les voies de l'iris et de l'épithélium pigmentaire rétinien.
- Valeur opérationnelle : Fournit des cellules différenciées terminales pour la validation fonctionnelle des cibles et la réduction des risques biologiques.
- Valeur stratégique : Renforce la confiance prédictive et permet le tri du portefeuille pour les programmes de maladies oculaires.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés pour des tests fonctionnels et génétiques ultérieurs.
- Valeur opérationnelle : Garantit la standardisation des tests, leur reproductibilité et des lectures quantitatives basées sur les cellules.
- Valeur stratégique : Améliore la préparation au criblage et la réutilisation de la plateforme pour l'évaluation de composés sur des cibles oculaires.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : S'aligne sur des systèmes pertinents pour l'étude de la dégénérescence rétinienne.
- Valeur opérationnelle : Garantit une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en utilisant des cellules primaires.
- Valeur stratégique : Soutient les décisions d'avancement ajustées au risque grâce à la réduction mécanistique des risques associés aux voies cibles.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre dans la continuité de la découverte, de la validation de la cible à la recherche préclinique, en fournissant des cellules épithéliales oculaires primaires pour des tests mécanistiques et phénotypiques.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en biologie des cellules épithéliales pigmentaires.
- Tri : Fournit des cellules prêtes à l'essai avec une isolation reproductible et un semis quantitatif pour le criblage de composés.
- Analytique : Permet le comptage cellulaire, l'évaluation de la viabilité et des lectures en aval pour l'analyse comparative de conditions.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique grâce à des cellules primaires pertinentes pour la maladie, permettant la validation de cibles rétiniennes.
- Réutilisation en entreprise : Met en place un protocole d'isolement réutilisable pour un approvisionnement constant en cellules IPE et RPE à travers différents projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive, validation des cibles, réduction de l'ambiguïté mécanistique concernant les cibles oculaires.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et évolutivité de l'isolement des cellules primaires.
- Valeur stratégique : Meilleures décisions de poursuite ou d'abandon, efficacité du capital et réduction des risques biologiques en phase avancée dans les programmes rétiniens.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation et décisions d'avancement ajustées au risque, fondées sur la validation fonctionnelle des cibles.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en dissection oculaire et en techniques de culture cellulaire primaire.
- Requiert un matériel stérile, de la trypsine, des milieux de culture et une infrastructure pour le comptage cellulaire.
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles de dissection et de dissociation enzymatique.
- Implique des adaptations selon la manipulation des différents tissus oculaires et les variations propres aux espèces.
- Comprend des limites pratiques telles que la disponibilité du tissu et l'optimisation enzymatique pour obtenir un rendement cellulaire constant.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
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Dernière mise à jour : 29 août 2026