Isolement des cellules IPE et RPE : une technique pour obtenir des cellules épithéliales de pigment oculaire à partir d’œil de lapin

Les cellules épithéliales pigmentaires sont des cellules cuboïdes différenciées en phase terminale reliées par des jonctions serrées. Ces cellules épithéliales qui tapissent l’iris sont les cellules épithéliales pigmentaires de l’iris ou cellules IPE, et celles proches de la rétine sont les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes ou EPR.

Pour extraire ces cellules, prenez un œil de lapin intact. Traitez l’œil avec un désinfectant pour éliminer tous les micro-organismes de la surface de l’œil. Lavez le désinfectant avec une solution tampon. Faites une incision près de l’iris. À l’aide de cette ouverture, faites une coupe circulaire complète le long de la limite de l’iris, divisant l’œil en un segment antérieur contenant l’iris et une partie postérieure comprenant la rétine et l’humeur vitrée.

Prenez le segment antérieur et jetez le cristallin pour accéder à l’iris. Retirez l’iris et placez-le sur une boîte de culture. Par la suite, prenez le segment postérieur et jetez l’humeur vitrée gélatineuse et la rétine du bulbe oculaire.

Traitez l’iris et le bulbe oculaire avec de la trypsine et incuber. La trypsine dégrade la jonction serrée et les protéines de la matrice extracellulaire, initiant la dissociation des cellules épithéliales. Jetez la trypsine et ajoutez un milieu de culture approprié. Grattez doucement la surface de l’iris et du bulbe oculaire pour libérer les cellules épithéliales dans le milieu.

Enfin, ensemencez les cellules IPE et RPE dans des puits séparés. Les cellules sont prêtes pour d’autres analyses en aval.

Après l’euthanasie de l’animal, utilisez des ciseaux incurvés et une pince Colibri pour énucléer les yeux, puis nettoyez le reste des tissus musculaires et de la peau des yeux. Prélevez les yeux dans un tube de 50 millilitres rempli de PBS non stérile et transférez le tube dans la hotte à flux laminaire. Désinfectez-les en les immergeant dans une solution à base d’iode pendant deux minutes, puis transférez les yeux dans un tube de 50 millilitres rempli de PBS stérile.

Placez un œil sur une compresse de gaze stérile et tenez fermement l’œil près du nerf optique, puis coupez près de la limite de l’iris avec un scalpel #11. À l’aide de ciseaux, coupez autour de l’iris, retirez le segment antérieur et placez-le dans une boîte de Pétri en laissant le bulbe avec le vitré, jusqu’à ce que les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes, ou EPR, soient isolées.

Pour isoler les cellules épithéliales pigmentaires de l’iris, ou cellules EPI, retirez le cristallin à l’aide d’une pince fine et retirez délicatement l’iris contenant les cellules EPI. Placez l’iris dans une boîte de Pétri et lavez-la avec du PBS stérile. Ajoutez 500 microlitres de trypsine à 0,25 % et incubez pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Retirez la trypsine, ajoutez 500 microlitres de milieu complet et grattez délicatement l’IPE avec une pipette plate Pasteur polie au feu.

Récupérez la suspension cellulaire et mettez-la dans un tube de 1,5 millilitre. Comptez les cellules à l’aide de la chambre de Neubauer et ensemencez 0,2 million de cellules par puits dans une plaque de 24 puits avec 1 millilitre de milieu complet. Placez l’assiette dans un incubateur et cultivez-la à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Pour isoler les cellules EPR, retirez l’humeur vitrée et la rétine du segment postérieur à l’aide d’une pince fine. Mettez les bulbes dans une plaque de 24 puits et ajoutez 500 microlitres de trypsine à 0,25 % par œil, et incubez pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Retirez la trypsine, ajoutez 500 microlitres de milieu complet par globe et grattez délicatement les cellules EPR avec une pipette Pasteur incurvée polie au feu.

Récupérez la suspension cellulaire et mettez-la dans un tube de 1,5 millilitre. Comptez les cellules à l’aide de la chambre de Neubauer et ensemencez les cellules comme décrit précédemment. Placez la plaque dans l’incubateur.