0 vues • 4:35 min • July 8th, 2025
Les bronchioles sont les voies respiratoires tubulaires des poumons. Lors d’une infection chronique, les bronchioles se bouchent en raison de l’accumulation de mucus. Le mucus riche en nutriments fournit un environnement propice à la croissance des bactéries opportunistes. Ces bactéries s’intègrent dans une matrice polymère extracellulaire autoproduite et prolifèrent pour former un biofilm.
Pour imiter le développement d’un biofilm bactérien sur les poumons, prélevez un échantillon de tissu bronchiolaire de porc dans une boîte de Pétri. Disséquez le tissu en morceaux de la forme souhaitée. Ajouter un milieu de culture de biofilm dans la boîte de Pétri. Stérilisez le plat à la lumière UV pour éliminer tous les contaminants de surface.
Transférez les morceaux de tissu stérilisés dans une plaque multipuits contenant des milieux de culture de biofilm et des coussinets d’agarose, qui servent de substrat optimal pour l’adhésion bactérienne. Ensuite, piquez une pointe d’aiguille contenant une colonie de bactéries souhaitées sur chaque morceau de tissu pour introduire des bactéries planctoniques dans le tissu. Scellez la plaque avec une membrane poreuse stérilisée aux UV qui facilite l’échange uniforme d’oxygène sur toute la surface de la plaque. Incuber la plaque scellée.
Pendant l’incubation, les bactéries adhèrent de manière irréversible à la surface épithéliale à travers les pili et commencent à sécréter la matrice extracellulaire. À l’intérieur de la matrice, les bactéries utilisent les sources d’énergie, la mucine et l’ADN libre des milieux de culture pour former des biofilms. Le modèle de biofilm bactérien est prêt pour d’autres tests.
Placez les bronchioles dans le premier lavage DMEM/RPMI 1640. Laissez-le dans le lavage et prélevez des sections supplémentaires de bronchiole dans le même poumon pour obtenir des sections de tissu suffisantes pour l’expérience prévue. Placez toutes les sections bronchiolaires supplémentaires du même poumon dans le lavage et laissez-les dans le lavage pendant au moins deux minutes.
Retirez les bronchioles du premier lavage et placez les échantillons dans une boîte de Pétri stérile. Tenez légèrement chaque bronchiole avec des pinces stériles, en prenant soin de ne pas endommager les tissus. Retirez autant de tissus mous restants que possible et coupez le tissu en bandes de cinq millimètres de large à l’aide de ciseaux de dissection stériles.
Placez toutes les bandelettes de tissu bronchiolaire dans le deuxième lavage DMEM/RPMI 1640. Laissez-les au lavage pendant au moins deux minutes. Ensuite, retirez les bandelettes de tissu du deuxième lavage à l’aide d’une pince stérile et placez-les dans une boîte de Pétri propre et stérile. Retirez tous les tissus mous restants attachés à la bronchiole et coupez les bandelettes en carrés à l’aide de ciseaux de dissection stériles.
Ajoutez le troisième lavage DMEM/RPMI 1640 dans la boîte de Pétri et mélangez légèrement les morceaux de tissu dans le lavage en remuant le plat. Versez le troisième lavage de la boîte de Pétri sans retirer les morceaux de tissu.
Ensuite, ajoutez le dernier lavage SCFM, en vous assurant que tous les morceaux de tissu sont recouverts. Stérilisez le tissu dans SCFM sous une lumière UV pendant cinq minutes. À l’aide d’une pince stérile, transférez chaque morceau de tissu bronchiolaire stérilisé dans les puits individuels d’une plaque à 24 puits contenant des coussinets d’agarose SCFM.
Pour infecter chaque morceau de tissu avec la souche bactérienne souhaitée, touchez une colonie cultivée sur une plaque de gélose avec la pointe d’une aiguille de calibre 29 attachée à une seringue d’insuline stérile de 0,5 millilitre. Ensuite, touchez la colonie sur le morceau de tissu, en piquant doucement la surface. Pour les témoins non infectés, piquez doucement la surface du morceau de tissu avec la pointe de l’aiguille.
Ensuite, à l’aide d’une pipette, ajoutez 500 microlitres de SCFM dans chaque puits. Stérilisez une membrane d’étanchéité respirante pour chaque plaque de 24 puits sous une lumière ultraviolette pendant 10 minutes. Retirez le couvercle de la plaque à 24 puits et remplacez-le par la membrane respirante. Ensuite, incubez les plaques à 37 degrés Celsius sans secouer.