Isolement des cellules endothéliales de l’aorte porcine (pAEC) : une méthode enzymatique pour isoler les cellules endothéliales de l’aorte abdominale porcine prélevée
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologie
0 vues • 4:50 min • July 8th, 2025
L’aorte - l’artère principale transportant le sang oxygéné du cœur vers le corps - est composée de trois couches ou « tuniques » : une intima interne, une médiane moyenne et une acécutive externe. Les cellules endothéliales ou EC sont présentes dans l’intima sous la forme d’une monocouche mince et continue sur une membrane basale de soutien composée de protéines structurales, principalement du collagène.
Pour isoler les CE, commencez par une aorte porcine récoltée dans une boîte de culture. Exciser ses extrémités et tout tissu adhérent environnant pour éviter la contamination des cellules non endothéliales. Lavez l’aorte avec un tampon contenant des antibiotiques pour inhiber la croissance microbienne.
Passez une suture chirurgicale stérile dans l’aorte et attachez l’une de ses extrémités, en maintenant la suture dans la lumière. Fixez l’extrémité attachée et rétractez la suture pour inverser complètement l’aorte. Cela expose l’intima contenant des CE à la digestion enzymatique. Traitez l’aorte avec une solution de collagénase préchauffée et peu concentrée pour une activité enzymatique optimale et incubez.
La collagénase décompose les protéines de collagène présentes dans la membrane basale sous-jacente aux CE, initiant leur dissociation. Après l’incubation, ajoutez un tampon réfrigéré pour inactiver les enzymes collagénase.
Grattez doucement la surface intimale de l’aorte et rincez-la avec un tampon pour libérer les CE dans la solution. Centrifugez cette solution pour granuler les EC. Remettez le granulé en suspension dans un milieu approprié. Ensemencez la suspension cellulaire dans un ballon de culture et incubez. Les CE adhèrent au fond du ballon et prolifèrent.
Pour l’isolement des cellules endothéliales de l’aorte aortique porcine, transférez l’aorte de porc dans une boîte de Pétri de 150 millimètres dans des conditions aseptiques et retirez délicatement les deux extrémités du vaisseau. Coupez tout excès de tissu supplémentaire à l’endroit où le vaisseau a été serré, à l’aide d’une pince et de ciseaux stériles, et utilisez 20 à 50 millilitres de tampon de lavage frais pour rincer l’extérieur et l’intérieur de l’aorte.
Ensuite, passez une suture chirurgicale à travers l’aorte et attachez sans serrer une extrémité du vaisseau, en maintenant la suture dans la lumière. Fixez doucement l’aorte près de l’extrémité attachée à l’aide d’une pince, puis tirez lentement sur les sutures chirurgicales pour inverser l’aorte jusqu’à ce que la surface endothéliale de l’aorte soit exposée.
Lavez la surface endothéliale de l’aorte trois fois avec 10 millilitres de tampon de lavage frais par lavage et placez l’aorte dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Couvrez l’échantillon avec 10 millilitres de solution digestive IV de collagénase IV à 0,005 % réchauffée à 37 degrés Celsius et incubez le tissu à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.
À la fin de l’incubation, transférez tout le contenu du tube dans une boîte de culture de 100 millimètres et arrêtez la digestion avec 10 à 15 millilitres de tampon d’arrêt pré-refroidi. À l’aide d’un grattoir cellulaire, retirez délicatement les cellules endothéliales aortiques de la surface intérieure du vaisseau et lavez le vaisseau trois fois avec 5 millilitres de tampon de lavage par lavage.
Après le dernier lavage, transférez le surnageant dans un tube à centrifuger de 50 millilitres et lavez le fond du plat de culture deux fois avec 5 millilitres de tampon de lavage frais par lavage, en regroupant les lavages dans le tube de 50 millimètres.
Recueillir les cellules par centrifugation et jeter tous les millilitres de surnageant, sauf les 10 derniers millilitres. Ajoutez 20 millilitres de tampon de lavage pour remettre les granulés en suspension en prenant soin d’éviter les bulles, et récupérez les cellules avec une autre centrifugation.
Remettez la pastille en suspension dans 1 millilitre de milieu de culture cellulaire pour le comptage, et plaquez les cellules à une concentration de 1 x 10 à 6 cellules par 25 centimètres carrés de flacon. Ensuite, placez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, en rafraîchissant le milieu tous les 2 à 3 jours.
Aperçu
Cet article décrit une méthode d'isolement de cellules endothéliales porcines (ECs) à partir de l'aorte, en précisant les étapes nécessaires pour garantir la pureté et la viabilité des cellules. Le protocole souligne l'importance des techniques aseptiques et de la digestion enzymatique pour une récupération efficace des cellules.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Biologie vasculaire
- Recherche sur les cellules endothéliales
Contexte
- L'aorte est l'artère principale chargée du transport du sang oxygéné.
- Elle est constituée de trois couches : intima, media et adventice.
- Les cellules endothéliales forment une monocouche essentielle dans l'intima.
- La mise en évidence de ces cellules est indispensable à diverses études biologiques.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole détaillé pour l'isolement de cellules endothéliales aortiques porcines.
- Garantir que la méthodologie minimise les contaminations et maximise le rendement cellulaire.
- Faciliter des recherches ultérieures sur le comportement et la fonction des cellules endothéliales.
Méthodes utilisées
- Prélèvement de l'aorte porcine et préparation pour l'isolement cellulaire.
- Utilisation de la collagénase pour la digestion enzymatique de la membrane basale.
- Utilisation de la centrifugation pour séparer les cellules endothéliales du tissu.
- Resuspension et culture des cellules isolées dans un milieu approprié.
Résultats principaux
- Isolation réussie de cellules endothéliales aortiques porcines viables.
- Les cellules se sont fixées aux flacons de culture et ont démontré une prolifération.
- Protocole optimisé pour une contamination minimale et un rendement élevé.
- Des étapes détaillées sont fournies afin d'assurer la reproductibilité dans les contextes de recherche.
Conclusions
- La méthode décrite est efficace pour isoler les cellules endothéliales de l'aorte porcine.
- Garantit une haute pureté et viabilité pour les expériences ultérieures.
- Peut être adaptée à des études similaires sur d'autres tissus vasculaires.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'isolement de cellules endothéliales primaires à partir de l'aorte porcine fournit un modèle physiologiquement pertinent pour l'étude de la biologie vasculaire et du dysfonctionnement endothélial en recherche préclinique. Cette méthode facilite la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques en permettant un accès reproductible à des phénotypes endothéliaux natifs pour le développement d'essais et le criblage de composés. L'accent mis par ce protocole sur la pureté et la viabilité améliore la fiabilité prédictive des flux de travail en phase de découverte précoce.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation de voies spécifiques aux cellules endothéliales et de la fonction des cibles thérapeutiques dans un contexte cellulaire natif.
- Valeur opérationnelle : Fournit une population cellulaire purifiée qui réduit les signaux perturbateurs provenant de contaminants non endothéliaux.
- Valeur stratégique : Soutient une validation ciblée fondée sur des hypothèses, avec une pertinence biologique améliorée par rapport aux lignées immortalisées.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Fournit des cellules endothéliales adaptées à des tests fonctionnels mesurant l'intégrité de la barrière, la migration et les réponses inflammatoires.
- Valeur opérationnelle : Un protocole d'isolement standardisé favorise la reproductibilité entre les expériences et les laboratoires.
- Valeur stratégique : Permet une préparation rapide des tests pour le criblage de composés ciblant les structures vasculaires.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Fournit un système pertinent pour modéliser l'activation et la dysfonction endothéliales dans les pathologies cardiovasculaires.
- Valeur opérationnelle : Permet une culture longitudinale et des repiquages pour des études précliniques prolongées.
- Valeur stratégique : Facilite la découverte de biomarqueurs translationnels et les études sur les mécanismes d'action.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode d'isolement s'inscrit dans le continuum de la découverte, allant de la validation de la cible au développement de tests jusqu'à l'évaluation préclinique, en offrant une source renouvelable de cellules endothéliales primaires pour des tests itératifs.
- Biologie de la découverte : Permet l'analyse mécanistique des cibles endothéliales et la modulation des voies biologiques.
- Criblage : Fournit des cellules normalisées et viables pour un profilage reproductible de la réponse aux composés.
- Analytique : Permet des lectures quantitatives telles que la production d'oxyde nitrique, la perméabilité et l'expression des molécules d'adhésion.
- Recherche translationnelle : Relie les résultats in vitro à la physiopathologie vasculaire grâce à des cellules conservant leur phénotype.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour l'évaluation de cibles vasculaires dans plusieurs projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance dans la cible en utilisant des cellules primaires qui conservent les caractéristiques endothéliales natives.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à des étapes définies de digestion enzymatique et de lavage.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en réduisant les faux positifs dus à une activation cellulaire artéfactuelle.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles vasculaires selon des données physiologiquement pertinentes.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en manipulation aseptique des tissus et en techniques de dissociation enzymatique.
- Dépend de l'accès à la collagénase IV et à du matériel d'incubation contrôlé.
- Exige des protocoles normalisés de lavage et de centrifugation afin de garantir la pureté cellulaire.
- Implique des ajustements d'optimisation lors de l'adaptation à des tailles de récipients ou à des espèces différentes.
- Est limité par la disponibilité de tissu aortique porcin frais et par la rapidité du traitement après la récolte.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
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Dernière mise à jour : 22 août 2026