Etudier Instabilité génomique fonction de l'âge en utilisant les S. cerevisiae Modèle chronologique Lifespan

L’objectif global de cette procédure est d’étudier l’instabilité génomique dépendante de l’âge chez la levure en combinant la durée de vie chronologique avec un ensemble de tests simples de dommages à l’ADN et de mutations. Pour ce faire, il échantillonne d’abord les cultures de vieillissement chronologique tous les deux jours et vérifie la viabilité par unité formant colonie ou formation d’UFC. La prochaine étape de la procédure consiste à examiner les mutations de l’ADN en échantillonnant des cultures vieillissantes et en plaquant les cellules sur un milieu de sélection spécifique à la mutation.

En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent des changements dans les mutations de l’ADN au cours du vieillissement chronologique de la levure en normalisant les résultats du test de mutation à la viabilité. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du vieillissement, telles que les mécanismes qui lient le vieillissement et l’instabilité génomique dans l’aria Pour tester la durée de vie chronologique de la levure ou CLS, inoculez d’abord une seule colonie de levure dans un millilitre de glucose complet synthétique, ou milieu SDC et incubez pendant la nuit en agitant à 30 degrés Celsius le lendemain. Diluer la culture de nuit dans 10 millilitres de milieu SDC frais à une OD 600 de 0,05 à 0,1 incuber en agitant à 30 degrés Celsius pendant trois jours.

Le troisième jour, lorsque les cellules sont en phase stationnaire, diluez chaque Eloqua 10 000 fois dans de l’eau d’autoclave, puis retirez deux aliquotes de 10 microlitres du ballon et mettez 10 microlitres de chaque culture diluée sur une plaque A-Y-E-P-D. Incuber la plaque à 30 degrés Celsius jusqu’à ce que des colonies se lèvent. Le nombre de colonies en naissance ou d’unités formant des colonies à partir du troisième jour de culture est considéré comme un taux de survie de 100 %.

Continuez à retirer les aliquotes de la culture de vieillissement les jours suivants pour le placage. Ajuster les facteurs de dilution en conséquence pour assurer la présence d’environ 20 à 100 colonies dans l’essai UFC. L’échantillonnage est arrêté lorsque la viabilité de la culture est tombée en dessous de 1 %typiquement entre les jours 11 et 13, la viabilité cellulaire peut également être étudiée dans des cellules vieillies sur plaques.

Pour commencer ce test, inoculez une seule colonie dans un millilitre de milieu de glucose complet synthétique et incubez pendant la nuit en agitant à 30 degrés Celsius. Lorsque la culture a atteint environ 10 à huit cellules par millilitre, diluez la culture avec de l’eau d’autoclave à 100 à 200 cellules par 10 microlitres et 1000 cellules par 10 microlitres. Pour chaque souche, préparez un ensemble de huit à 20 plaques de décrochage du trytophane étiquetées en fonction de la densité de placage.

Pour s’assurer que 10 à 100 colonies peuvent être comptées en prévision d’une diminution de la viabilité pendant le vieillissement sur plaque, deux aliquotes de 10 à 30 microlitres de culture diluée sur chaque plaque. Incuber la plaque réglée à 30 degrés Celsius pendant toute la durée de l’analyse de la durée de vie le jour du placage et tous les deux jours par la suite, retirer une plaque et ajouter goutte à goutte 0,5 millilitre de trytophane pour permettre aux cellules viables de se développer. Incuber la plaque à 30 degrés Celsius pendant 48 à 72 heures supplémentaires.

Après 48 à 72 heures. Comptez l’UFC pour la viabilité du jour de l’édition du tryptophane pour tester quatre dommages à l’ADN et la fréquence des mutations au cours du vieillissement chronologique. Un certain nombre d’étranges avec des caractéristiques spéciales sont cultivés en parallèle avec la souche de type sauvage pour le test CLS de levure.

La fréquence des mutations spontanées peut être évaluée en mesurant la fréquence de résistance au vanning de canna dans une culture de vieillissement chronologique. Les mutations dans le gène can one qui code pour la perméase plasmatique de l’arginine rendent les cellules résistantes à l’analogue de l’arginine L Canavan Les cellules résistantes à Canavan se développeront sur la perte d’arginine Plaques de milieu synthétique complètes complétées par L Canavan sulfate Mesure de la fréquence de réversion positive du trip dans une souche contenant une mutation ambrée dans le trip. Une séquence d’enrobage permet d’estimer le taux de substitution de base lors du vieillissement chronologique de la levure.

Les cellules de réversion positive se développeront sur les plaques de chute du tryptophane. La souche négative de lyse EH one 50 présente un décalage de plus quatre dans le cadre de lecture ouvert, ce qui entraîne une atrophie ox pour la lysine, et cela peut être inversé par de petites mutations d’insertion ou de délétion. Les révertants seront sélectionnés sur des plaques de chute de lysine pour détecter les réarrangements chromosomiques macroscopiques ou gcr.

Une souche mutante est utilisée dans laquelle HX T 13 situé à 7,5 kilobases télomériques à un sur le chromosome cinq est perturbé par un U trois : les mutations de la cassette dans les gènes Can One et U trois rendent les cellules résistantes à L Canavan et à cinq acides fluoroorotiques respectivement. Étant donné que la fréquence des mutations ponctuelles se produisant dans les deux gènes est faible, l’analyse de la fréquence de résistance à El Canavan et à cinq acides fluoroorotiques fournit une estimation de gcr pour surveiller le niveau de recombinaison homologue et homologue. Au cours du vieillissement chronologique, des mutants sont générés qui portent soit des répétitions inversées homologues à 100 %, soit homologues à 91 %.

L’IRS à la recombinaison de ses trois locus entre l’IRS permet l’expression de ses trois protéines fonctionnelles. Par conséquent, les cellules dans lesquelles la recombinaison s’est produite se développeront sur des plaques de chute d’histidine complétées par du galactose. Le troisième jour, lorsque les cellules sont en phase stationnaire et qu’une quantité appropriée de cellules sera retirée de chaque culture vieillissante.

Étant donné que la même procédure est utilisée pour tous les essais, un seul échantillon sera traité. Pour les besoins de cette vidéo, granulez les cellules en les faisant tourner dans une centrifugeuse de paillasse. Retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de pastille d’eau d’autoclave.

Encore une fois, retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 100 microlitres de cellules de plaque d’eau sur les plaques appropriées pour sélectionner les retours souhaités. Incuber des plaques à 30 degrés Celsius après trois à quatre jours de comptage des UFC, la fréquence de mutation est normalisée en fonction du nombre de cellules viables. Ce graphique montre les résultats représentatifs d’un essai de durée de vie chronologique typique lorsque la survie chronologique des cellules de type sauvage est comparée à celle des mutants S, CH, neuf, TOR, TOR, un delta, et RA, deux, delta.

Dans les mutants en culture liquide dépourvus de TOR un s, CH neuf ou RA deux montrent une durée de vie chronologique prolongée. De plus, les carences en S CH neuf et en AR deux montrent un effet additif sur la promotion de la longévité et la survie chronologique en présence de diverses sources de carbone. L’utilisation de l’essai de viabilité NC deux est illustrée dans le graphique suivant.

Le premier jour, les cultures de type sauvage SDC ont été diluées et plaquées sur des plaques de décrochage SC sans source de carbone. Les plaques d’abandon SC Tripp complétées par de l’éthanol de glucose ou des plaques d’orates de glycérol ont été incubées à 30 degrés Celsius tous les deux jours. Une plaque a été récupérée de chaque ensemble et des nutriments appropriés ont été ajoutés pour permettre la croissance et la formation de la colonie.

La fréquence des mutations en fonction de l’âge varie considérablement en fonction de la souche, des antécédents, de la manipulation génétique, de la culture, des conditions et de l’âge. Ce tableau montre les résultats typiques obtenus dans une souche de type sauvage. Les résultats représentatifs de la synthèse translésionnelle sont présentés dans l’image suivante.

L’augmentation de la fréquence des mutations en fonction de l’âge peut impliquer des modifications dans la réparation erronée de l’ADN à l’aide d’extraits nucléaires et de divers modèles d’ADN. Nous pouvons évaluer la synthèse de traduction ou TLS dans les cellules chronologiquement âgées. Des extraits nucléaires de cellules mutantes delta de la phase stationnaire de trois jours, de type sauvage et de SCH neuf ont été analysés.

Les produits TLS avec un modèle non endommagé sont indiqués par des lignes continues et les produits TLS avec un modèle endommagé sont indiqués par des lignes pointillées. Il n’y a pas eu de synthèse translésionnelle observée dans les extraits nucléaires de la CH à longue durée de vie. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer l’analyse chronologique de la durée de vie et des mutations de l’ADN chez la levure.