Édition du génome CRISPR tout-en-un : une méthode d’inhibition de gènes basée sur la réparation dirigée par homologie dans des cellules cultivées à l’aide du système CRISPR-Cas9

Commencez par ajouter un plasmide CRISPR tout-en-un aux cellules immunitaires présentes dans un tube. Ce plasmide contient un gène Cas9 en combinaison avec la séquence codant pour l’ARNsg ou ARN monoguide, complémentaire à la séquence cible dans le génome de l’hôte.

Ajoutez un plasmide donneur linéarisé contenant un transgène pris en sandwich entre des bras d’homologie ou des HA - les répétitions d’ADN nécessaires à la recombinaison homologue. Effectuez l’électroporation, qui utilise un courant électrique pour injecter le mélange plasmidique dans la cellule. Une fois à l’intérieur, l’ARNsg traité forme un complexe avec la nucléase Cas9 exprimée.

L’ARNsg se lie au site cible, ce qui permet à la nucléase Cas9 d’identifier la séquence de reconnaissance spécifique connue sous le nom de motif adjacent protospacer ou PAM, et de cliver l’ADN de l’hôte à proximité. Cela crée une cassure double brin à extrémité émoussée où la machinerie cellulaire résecte l’ADN, générant des surplombs de 3'. La présence de sites flanquants HA déclenche le mécanisme de réparation dirigé par homologie où l’ADN coupé rejoint la séquence HA, formant une structure hétéroduplex - la boucle D.

La synthèse de l’ADN