Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 5:12 min • July 8th, 2025
Commencez par ajouter un plasmide CRISPR tout-en-un aux cellules immunitaires présentes dans un tube. Ce plasmide contient un gène Cas9 en combinaison avec la séquence codant pour l’ARNsg ou ARN monoguide, complémentaire à la séquence cible dans le génome de l’hôte.
Ajoutez un plasmide donneur linéarisé contenant un transgène pris en sandwich entre des bras d’homologie ou des HA - les répétitions d’ADN nécessaires à la recombinaison homologue. Effectuez l’électroporation, qui utilise un courant électrique pour injecter le mélange plasmidique dans la cellule. Une fois à l’intérieur, l’ARNsg traité forme un complexe avec la nucléase Cas9 exprimée.
L’ARNsg se lie au site cible, ce qui permet à la nucléase Cas9 d’identifier la séquence de reconnaissance spécifique connue sous le nom de motif adjacent protospacer ou PAM, et de cliver l’ADN de l’hôte à proximité. Cela crée une cassure double brin à extrémité émoussée où la machinerie cellulaire résecte l’ADN, générant des surplombs de 3'. La présence de sites flanquants HA déclenche le mécanisme de réparation dirigé par homologie où l’ADN coupé rejoint la séquence HA, formant une structure hétéroduplex - la boucle D.
La synthèse de l’ADN se poursuit, formant un brin complémentaire à la séquence du transgène jusqu’à ce qu’il rejoigne le brin d’ADN d’origine. Le haut de la boucle en D agit comme un modèle pour synthétiser la partie manquante de l’ADN, générant les doubles jonctions de Holliday - des structures où quatre brins d’ADN interagissent. Ces jonctions se résolvent et les lacunes se réparent, facilitant ainsi l’insertion du gène cible.
Préparez une plaque de 24 puits contenant 500 microlitres de milieu de croissance complet sans antibiotiques dans chaque puits. Préchauffez la plaque dans un incubateur humidifié à 37 degrés 5 % de dioxyde de carbone. Allumez le système d’électroporation. Paramètres d’électroporation d’entrée pour les cellules JURKAT ou RAW.
Préparez le mélange cellule-ADN pour l’électroporation. Prélever la culture de cellules JURKAT dans une fiole de 25 centimètres carrés. Transférer les cellules dans un tube à centrifuger de 50 ml. Ensuite, granulez les cellules par centrifugation à 90 x g pendant huit minutes à température ambiante.
En ce qui concerne les surnageants, pour le lavage, remettre en suspension les cellules avec 5 mL de DPBS. Ensuite, faites tourner la suspension cellulaire par centrifugation, en utilisant les mêmes conditions que l’étape précédente. Retirez le DPBS et remettez en suspension la pastille de cellule à l’aide de 2 mL de DPBS. Utilisez 10 microlitres de suspension cellulaire et mélangez avec un volume égal de bleu de trypan à 0,2 %.
Pour estimer le nombre de cellules, chargez l’échantillon dans cette lame de comptage. Insérez une diapositive de comptage dans le compteur de cellules automatisé et affichez l’image des cellules, puis obtenez un résultat de comptage de cellules. Calculez 2 millions de cellules pour 5 répétitions d’électroporation, par expérience de knock-in.
Transférez le nombre requis de cellules dans un tube à centrifuger de 1,5 ml. Cellules à granulés par centrifugation. Pour gagner du temps, un mélange d’électroporation peut être préparé lors de l’étape de centrifugation. Ajoutez 2,5 microgrammes de chacun des vecteurs CRISPR-Cas9, 2,4 microgrammes de vecteur de ciblage linéarisé et remettez en suspension le tampon R, pour un volume total de 55 microlitres, dans un nouveau tube à centrifuger de 1,5 ml.
Tourbillonnez doucement et tournez brièvement pour bien mélanger. Laissez le mélange d’électroporation à température ambiante avant utilisation. Après l’essorage, aspirez le DPBS, puis centrifugez-le pendant 30 secondes supplémentaires. Retirez autant de surnageant que possible. Remettez les cellules en suspension en ajoutant le mélange d’électroporation préparé. Pipette de haut en bas doucement.
Électroporation : Comme pour le mélange d’électroporation de cellule, utilisez une pointe de nucléofection de 10 microlitres avec pipette.
Important : Évitez les bulles d’air pendant le pipetage, cela provoquerait une défaillance de l’électroporation. Appuyez sur « Démarrer ».
Après l’électroporation, transférez l’échantillon dans un puits de plaques de 24 puits avec un milieu de croissance préchauffé. Effectuez les mêmes procédures d’électroporation que ci-dessus, sur les 4 échantillons répétés restants. Basculez doucement la plaque pour assurer une répartition uniforme des cellules. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 degrés pendant 48 à 72 heures avant le tri cellulaire FACS.