JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniques biologiques
0 vues • 4:34 min • July 8th, 2025
Pour la transfection inverse de petits ARN interférents, ou siRNA, une classe d’ARN double brin, dans des adipocytes ou des cellules adipeuses non adhérents, préparez une suspension de siRNA ciblant un gène codant pour une protéine spécifique dans les adipocytes. Ajouter un réactif de transfection à base de lipides cationiques approprié. Incuber le mélange pour former des complexes de transfection par interactions électrostatiques.
Transférez le mélange dans les puits enrobés de collagène d’une plaque multi-puits. Les complexes de transfection s’immobilisent sur le revêtement de la plaque par des interactions non spécifiques. Pipeter une suspension d’adipocytes dans des puits contenant des complexes de transfection immobilisés. Les adipocytes adhèrent lâchement à l’enrobage de la plaque, augmentant le contact physique entre les cellules et les complexes.
Le complexe de transfection fusionne avec la membrane cellulaire et délivre l’ARNi dans le cytoplasme. Le siRNA, composé d’un brin antisens avec une séquence complémentaire à l’ARNm cible et d’un brin sens, est reconnu par le complexe de silençage multiprotéique induisant l’ARN, ou RISC. L’ARNi se lie au RISC et les brins se séparent, le brin antisens restant lié au complexe.
Le complexe siRNA-RISC activé reconnaît et se lie aux sites complémentaires de l’ARNm cible. Cela conduit à un clivage spécifique de la séquence de l’ARNm par la protéine argonaute du complexe RISC. L’ARNm clivé est davantage dégradé par la machinerie cellulaire, réduisant ainsi au silence l’expression des gènes cibles.
Pipeter l’ARNi avec le milieu essentiel minimum amélioré à mélanger et incuber pendant 5 minutes à température ambiante. Ajouter le réactif de transfection et le milieu essentiel minimal amélioré à l’ARNsi, et pipeter pour mélanger. Incuber pendant 20 minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez le mélange de transfection dans chaque puits de la plaque recouverte de collagène.
Lavez deux fois les cellules de la boîte de Pétri de 100 millimètres avec du DPBS. Ajoutez de la trypsine 5X aux cellules, en vous assurant de couvrir toute la surface avec la trypsine. Attendez 30 secondes et retirez soigneusement la trypsine. Incuber la boîte de Pétri pendant 5 à 10 minutes à 37 °C dans l’incubateur.
Ensuite, tapotez la parabole pour détacher les cellules, évitant ainsi d’endommager les cellules. Ajoutez 10 millilitres de DMEM sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10 % de FCS et 1 % de pénicilline et de streptomycine, pour neutraliser la trypsine. Pipetez soigneusement le milieu de haut en bas pour détacher les cellules et homogénéiser la suspension cellulaire.
Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage Malassez ou d’un compteur de cellules automatisé, et ajustez la concentration des cellules à 6,25 x 105 cellules/mL de milieu. Semez 800 microlitres de suspension cellulaire par puits d’une plaque de 12 puits, ou 400 microlitres de suspension cellulaire par puits d’une plaque de 24 puits contenant le mélange de transfection.
Incuber les plaques dans un incubateur de culture cellulaire et ne pas les déranger pendant 24 heures. Le lendemain, remplacez soigneusement le surnageant par du DMEM frais sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10 % de FCS et 1 % de pénicilline et de streptomycine, et retournez les cellules dans l’incubateur.