Système régulable Tet-Off inductible : méthode in vitro pour moduler l’expression génique dans des cellules cultivées à l’aide d’un système de tétracycline-off
Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 6:19 min • July 8th, 2025
Commencez par prendre une suspension de cellules receveuses cultivées dans un tube. Complétez le tube avec des plasmides inductibles contenant le gène d’intérêt. L’expression de ce gène est sous le contrôle d’une séquence promotrice en amont fusionnée à un opérateur de tétracycline ou TetO, formant un élément sensible à la tétracycline ou TRE.
De plus, ajoutez des vecteurs régulateurs de la tétracycline, chacun contenant un gène codant pour la protéine transactivatrice de la tétracycline recombinante ou tTA. Électroporez le mélange cellule-ADN pour utiliser des impulsions électriques afin de faciliter l’absorption des plasmides par la cellule.
Après l’électroporation, plaquez les cellules et incubez pendant la durée souhaitée. En entrant dans le noyau, le vecteur tétracycline-off exprime la protéine tTA. Le tTA est une protéine hybride contenant un répresseur Tet ou la fraction TetR et un domaine transactivateur de transcription viral VP16.
Lafraction TetR se lie à la séquence TetO de l’élément TRE, tandis que le domaine VP16 permet à l’ARN polymérase de synthétiser l’ARNm à partir de l’ADN en aval, conduisant finalement à l’expression génique. Remplacer le milieu de culture dans
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques