Transgenèse du poisson-zèbre par transposon Tol2 : une procédure pour générer un poisson-zèbre transgénique suite à la co-injection du système Tol2 dans des embryons de poisson-zèbre fécondés

Commencez avec des embryons viables de poisson-zèbre au stade unicellulaire placés dans les puits d’un moule de micro-injection.

Chargez une aiguille de micro-injection avec une solution contenant de l’ARNm codant pour la transposase Tol2 et des plasmides donneurs de transposons. Les plasmides comprennent un promoteur de poisson zèbre omniprésent et un gène codant pour une protéine fluorescente flanqué de bras de transposon Tol2.

Injectez soigneusement la solution de micro-injection dans le cytoplasme de l’embryon de poisson-zèbre. À l’intérieur de la cellule, les ARNm de la transposase Tol2 se transforment en protéines transposases de Tol2 et sont activement transportés dans le noyau.

Les sites Tol2 sur le plasmide donneur comprennent des répétitions terminales inversées spécifiques, ou ITR, flanquant le gène rapporteur. Les ITR sont flanqués de courtes répétitions directes. Les protéines transposases reconnaissent et se lient aux sites ITR, formant une épingle à cheveux sur l’ADN flanquant. Les transposases clivent davantage la construction du transposon de l’ADN flanquant, le libérant du plasmide et laissant derrière elles de courtes répétitions directes.

Les transposases créent une cassure double brin décalée dans le génome de la cellule somatique et insèrent la construction du transposon dans le site du génome. Le remplissage des extrémités décalées par l’ADN polymérase suivi d’une ligature des entailles crée des répétitions courtes et directes.

La ligature provoque l’intégration stable de la construction du transposon dans le génome de la cellule somatique, et le promoteur facilite l’expression de la protéine fluorescente. Incuber les embryons injectés. Au cours du développement embryonnaire, les cellules somatiques donnent naissance à différents types de cellules et créent des poissons-zèbres transgéniques.

Après avoir préparé l’ARNm de la transposase Tol2 et la solution d’injection, conformément au protocole de texte, l’après-midi précédant l’injection, mettez en place quatre à six bassins d’élevage avec au moins deux mâles et deux femelles. Pour réduire la quantité de déchets de poissons et induire une réponse de reproduction, évitez de nourrir les poissons l’après-midi.

Le lendemain matin, retirez la solution d’injection préparée du congélateur à moins 80 degrés Celsius et placez-la sur de la glace. Tirez les séparateurs dans les aquariums d’élevage de poissons et laissez les poissons s’accoupler. En général, les poissons pondent leurs œufs dans les 20 à 30 minutes.

Pendant l’attente, à l’aide d’un extracteur de micropipette avec les paramètres suivants, retirez les aiguilles du verre capillaire. Utilisez une lingette de laboratoire pour casser l’extrémité de l’aiguille et créer un bord biseauté. Un diamètre plus petit est préférable pour réduire la mortalité embryonnaire.

Une fois que les poissons ont pondu leurs œufs, récupérez-les dans une boîte de Pétri de 10 centimètres de diamètre. Immédiatement sous le microscope de dissection, retirez tous les embryons anormaux et les déchets de poisson. Ensuite, pipetez les embryons fécondés dans un moule d’injection d’agarose préparé à 3 %. Retirez l’excès d’eau pour aider à maintenir les embryons en place.

Une fois que toutes les rangées sont remplies d’embryons viables, disposez-les de manière à ce que les cellules individuelles soient toutes orientées à un angle horizontal de 45 degrés par rapport à l’aiguille. Cela rendra l’injection beaucoup plus facile plus tard. Ensuite, tout en portant des gants, utilisez une pointe de pipette de chargement de 20 microlitres pour retirer 5 microlitres de la construction préparée du tube sur de la glace.

Insérez soigneusement la pointe de la pipette dans l’extrémité arrière du tube capillaire cassé jusqu’à l’endroit où elle commence à se rétrécir, pour rapprocher le réactif le plus possible de la pointe, et expulsez-le dans le capillaire. S’il y a encore des bulles d’air, secouez l’aiguille en veillant à ne pas casser la pointe.

Insérez l’aiguille directement dans le porte-aiguille de micro-injection et serrez soigneusement jusqu’à ce que l’aiguille reste en place, puis ajustez l’angle à environ 45 degrés. Une fois l’aiguille préparée et fixée, allumez le microscope et le réservoir de gaz sous pression. Ajustez le volume d’injection en utilisant environ 0,5 PSI pour le maintien et 30 PSI pour l’éjection.

Vérifiez que la solution s’éjecte de l’aiguille lorsque vous appuyez sur la pédale. À l’aide d’un micromètre platien avec une goutte d’huile minérale, ajustez le volume et le débit de la solution à environ 10 micromètres de diamètre. Assurez-vous que la contre-pression permet à une petite quantité de solution de s’écouler de l’aiguille.

S’il n’y a pas assez de contre-pression, l’action capillaire fera pénétrer le liquide dans l’aiguille et détruira l’ARNm. Une fois l’aiguille calibrée, insérez-la dans la cellule unique des embryons fécondés en utilisant le bord de l’encoche de gel pour fournir un support qui maintient l’embryon en place et permet à l’aiguille d’appliquer une pression sans déplacer l’embryon.

Une fois que la pointe de l’aiguille est dans la cellule unique, appuyez sur la pédale pour libérer la quantité souhaitée de solution. Il est important d’injecter la solution dans la cellule, et non le jaune pour générer du poisson-zèbre transgénique. Répétez ce processus pour tous les embryons.

Une fois terminé, utilisez une pipette de transfert jetable de 3,4 millilitres et de l’eau du système Fish pour transférer les embryons injectés dans une boîte étiquetée en les rinçant de l’encoche d’agarose. Conservez les embryons dans un incubateur à 28,5 degrés Celsius pour les laisser se développer.