Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
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Commencer par une suspension de cellules souches pluripotentes induites par l’homme, les hiPSC, dans un tampon d’électroporation approprié. Ajoutez une solution composée de plasmides codant pour la transposase PiggyBac et de plasmides donneurs. Électroporez le mélange.
Les impulsions électriques pénètrent transitoirement les membranes cellulaires, facilitant l’absorption cellulaire des plasmides. Les plasmides donneurs comprennent des répétitions terminales inversées spécifiques aux transposons, les ITR, qui sont des compléments inversés les uns des autres, flanqués de répétitions TTAA encadrant la protéine cible et les gènes de résistance aux antibiotiques.
Les protéines de transposase PiggyBac exprimées créent des entailles aux extrémités 3' des ITR, internes aux répétitions TTAA. Les groupes 3'-hydroxyle exposés attaquent le nucléotide du brin complémentaire à l’intérieur de l’ADN flanquant, formant des épingles à cheveux TTAA aux extrémités du transposon, libérant ainsi la construction du transposon du plasmide.
Les transposases résolvent les épingles à cheveux pour former des surplombs TTAA aux extrémités 5' de la construction du transposon. Les transposases créent en outre des cassures double brin au niveau de la séquence TTAA dans le génome de l’hôte. Les extrémités du transposon 3'-hydroxyle libérées attaquent la séquence TTAA aux extrémités décalées, ce qui entraîne une jonction covalente de la construction du transposon au génome de l’hôte, laissant des espaces monocaténaires flanquant la construction du transposon. Ces lacunes dans l’ADN de l’hôte sont ligaturées, ce qui conduit à une intégration stable de la construction du transposon.
Traiter les hiPSC ensemencées sur une plaque recouverte de protéines de matrice extracellulaire avec un milieu contenant des antibiotiques. Le gène de résistance aux antibiotiques, piloté par le promoteur en amont, permet la sélection des cellules génétiquement modifiées.
Rincez la culture humaine d’iPSC avec du PBS sans calcium ni magnésium, avant de traiter les cellules avec un réactif de dissociation cellulaire pendant 5 à 10 minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules ont commencé à se détacher du récipient de culture, utilisez une pipette P1000 pour dissocier doucement les cellules manuellement 3 à 4 fois.
Transférez les cellules dans un tube de 15 millilitres et portez le volume final à 10 millilitres avec du PBS frais sans calcium ni magnésium, pour compter. Collecter 1 x 106 cellules par centrifugation, et remettre en suspension la pastille dans 100 microlitres de tampon R du kit d’électroporation.
Ajoutez 4,5 microgrammes d’ADN plasmidique vecteur transposable et 0,5 microgramme d’ADN plasmidique transposase PiggyBac pour la transfection. Transfect avec le système d’électroporation de la cellule selon les instructions du fabricant, avec les paramètres indiqués. Alors. Ensemencez les cellules dans un milieu iPSC humain complété par 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK Y-27632 dans une boîte recouverte d’une matrice de 6 millimètres.