Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
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Commencer par une suspension de cellules souches pluripotentes induites par l’homme, les hiPSC, dans un tampon d’électroporation approprié. Ajoutez une solution composée de plasmides codant pour la transposase PiggyBac et de plasmides donneurs. Électroporez le mélange.
Les impulsions électriques pénètrent transitoirement les membranes cellulaires, facilitant l’absorption cellulaire des plasmides. Les plasmides donneurs comprennent des répétitions terminales inversées spécifiques aux transposons, les ITR, qui sont des compléments inversés les uns des autres, flanqués de répétitions TTAA encadrant la protéine cible et les gènes de résistance aux antibiotiques.
Les protéines de transposase PiggyBac exprimées créent des entailles aux extrémités 3' des ITR, internes aux répétitions TTAA. Les groupes 3'-hydroxyle exposés attaquent le nucléotide du brin complémentaire à l’intérieur de l’ADN flanquant, formant des épingles à cheveux TTAA aux extrémités du transposon, libérant ainsi la construction du transposon du plasmide.
Les transposases résolvent les épingles à cheveux pour former des surplombs TTAA aux extrémités 5' de la construction du transposon. Les transposases créent en outre de
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