Administration de gènes basée sur un virus adénologique recombinant : une technique de livraison de transgènes et d’expression spécifique au cancer dans un modèle de rongeur

Le virus adéno-associé recombinant, rAAV, est un petit virus à ADN simple brin génétiquement modifié pour cibler un type de cellule spécifique et transporter sa cargaison génétique vers le noyau de la cellule hôte pour l’expression des gènes.

Commencez par retenir un chiot souris cryo-anesthésié. Stérilisez la peau du dos et injectez par voie sous-cutanée le vecteur rAAV porteur du transgène souhaité le long d’un promoteur spécifique cardiaque. Le vecteur est absorbé par le système vasculaire et atteint des organes éloignés, y compris le cœur.

Ici, le virus recombinant se fixe à la surface du cardiomyocyte et est internalisé par endocytose dans un endosome. À l’intérieur de l’endosome, la capside virale se désassemble partiellement, exposant les protéines lytiques virales. Cette protéine induit des pores dans la membrane endosomale, à travers lesquels le vecteur s’échappe dans le cytoplasme.

Le vecteur se déplace à travers les microtubules cytoplasmiques et pénètre par le pore nucléaire. Une fois dans le noyau, la capside virale se désassemble pour libérer son génome. L’ADN simple brin porteur du gène cible est ensuite converti en ADN double brin.

Après la transcription de l’ADN, l’ARNm produit se déplace dans le cytoplasme. Ici, l’ARNm subit une traduction, exprimant la protéine cible dans les cardiomyocytes. Observez des échantillons de tissus de différents organes à l’aide d’un microscope à fluorescence afin de déterminer l’efficacité et la spécificité tissulaire de l’administration du gène au cœur.

Après avoir déterminé le titre viral selon le protocole de texte, préparez des solutions de travail rAAV9 avec des titres de virus de 1 à 7 x 10¹² particules par millilitre. Pour traiter les souris néonatales, utilisez la solution rAAV9 pour préremplir une seringue à insuline de 0,33 x 12,7 millilitres avec une aiguille de calibre 29 de 1/2 pouce, en évitant les bulles d’air.

Après avoir cryoanesthésié un chiot, tenez-le dans une main avec le pouce et l’index. Ensuite, balayez la peau arrière du chiot avec un bâtonnet d’écouvillon saturé d’alcool isopropylique à 70 %. Insérez l’aiguille de la seringue dans l’hypoderme antéro-dorsal de l’animal à un angle de 5 à 10 degrés avant d’injecter 50 à 70 microlitres de la solution rAAV9.