Transformation génétique médiée par Agrobacterium : une méthode pour transformer génétiquement le génome du riz via Agrobacterium tumefaciens génétiquement modifié

Agrobacterium tumefaciens, une bactérie phytopathogène, peut être génétiquement modifiée en introduisant un plasmide Ti préparé artificiellement, portant un gène d’intérêt dans sa région de transfert d’ADN ou d’ADN-T, et un plasmide auxiliaire portant les gènes de virulence ou Vir pour transférer l’ADN-T dans les cellules végétales.

Pour la transformation génétique médiée par Agrobacterium, commencez par une jeune inflorescence de riz et coupez-la en petits morceaux. Transférez les boutures dans un milieu de croissance et incubez pour faciliter la croissance des boutures en une masse cellulaire indifférenciée appelée callosité.

Maintenant, transférez le cal dans un milieu d’infiltration Agrobacterium contenant de l’acétosyringone - un chimioattractant pour Agrobacterium. Ensuite, ajoutez une culture d’Agrobacterium génétiquement modifiée au milieu et incubez brièvement.

Les molécules d’acétosyringone activent la protéine réceptrice cellulaire - VirA - sur la membrane d’Agrobacterium, qui médie ensuite la phosphorylation d’une protéine activatrice transcriptionnelle - VirG. Le VirG phosphorylé se déplace vers le plasmide auxiliaire et active la transcription d’une cascade de gènes de virulence, y compris les protéines de canal et les endonucléases - VirD1 et VirD2.

Les protéines du canal forment un canal de transport reliant la cellule bactérienne et la cellule végétale, tandis que les endonucléases se lient aux séquences de bordure du plasmide Ti et clivent l’ADN-T avec VirD2, lié à une extrémité. Par la suite, VirD2 dirige l’entrée de l’ADN-T via le canal de transport dans les cellules calleuses et facilite son intégration dans le génome du riz.

Essuyez chaque inflorescence avec un tampon d’alcool à 70 % et laissez-la sécher avant de la couper. Apportez l’inflorescence sur une paillasse de laboratoire stérile et coupez-la en petits morceaux avec des ciseaux stérilisés. Ensuite, transférez les boutures sur une plaque de Pétri contenant du milieu NBD2.

Incuber l’assiette dans l’obscurité à 26 degrés Celsius, pendant 10 à 14 jours pour induire des callosités. Pour effectuer la transformation, transférez une seule colonie de la plaque YEB avec des antibiotiques sélectifs dans 5 millilitres de milieu liquide YEB contenant les mêmes antibiotiques, dans un tube à essai stérile conique de 50 millilitres. Agitez le tube sur un agitateur orbital à 250 x g et à 25 à 28 degrés Celsius jusqu’à ce que les bactéries atteignent une OD₆₀₀ de 0,5.

Ajoutez 1 millilitre de suspension bactérienne à 100 millilitres de milieu YEB avec les mêmes antibiotiques sélectifs, dans une fiole conique de 250 millilitres, et agitez la fiole sur un agitateur orbital à 250 x g et 28 degrés Celsius pendant quatre heures. Centrifugez la culture à 4 000 x g pendant 10 minutes à température ambiante, pour recueillir les bactéries. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension avec le milieu AAM-AS, puis diluez la suspension à_{une OD 600} de 0,4.

Après l’incubation, recueillez environ 150 cals embryogéniques sains, jaune clair, dans une fiole stérile de 150 millilitres. Ajoutez 50 à 75 millilitres de suspension de cellules bactériennes dans le ballon, puis ajoutez 10 à 25 millilitres de milieu frais AAM-AS, pour immerger les calli pendant 10 à 20 minutes, en secouant de temps en temps.

Versez soigneusement la suspension bactérienne hors du ballon et séchez les cals avec du papier filtre stérile. Ensuite, placez-les sur une boîte de Pétri avec du milieu NBD-AS et couvrez-les de papier filtre. Incuber les cals à une température de 25 à 28 degrés Celsius dans l’obscurité pendant trois jours, en vérifiant qu’ils ne contiennent pas de prolifération bactérienne.

Après trois jours de co-culture, transférez les cals dans une boîte de Pétri stérile à l’aide de papier filtre, puis faites-les sécher à l’air libre pendant deux heures sur un banc propre. Assurez-vous que les calli n’adhèrent pas au papier filtre et transférez-les sur le support de sélection primaire NBD2.

Après deux semaines, transférez uniformément les calli dans une nouvelle assiette contenant du milieu de sélection frais. Ensuite, déplacez les cals dans un milieu MS frais pour la différenciation, et les bourgeons poussaux dans un milieu MS (avec 10 mg/L d’hygromycine) pour faire proliférer plus de pousses.