JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniques biologiques
0 vues • 3:59 min • July 8th, 2025
Pour l’administration d’ADN plasmidique basée sur l’électroporation dans les cellules neuronales primaires, commencez par une suspension des cellules dans un milieu d’électroporation approprié. Ajoutez de l’ADN plasmidique codant pour des protéines fluorescentes pour préparer le mélange d’électroporation.
Transférez doucement le mélange d’électroporation dans une cuvette d’électroporation, en évitant les bulles d’air qui pourraient affecter négativement l’efficacité de l’électroporation. Transférez la cuvette dans le porte-cuvette de l’électroporateur ; Réglez les paramètres d’électroporation. Initier l’électroporation.
Les courtes impulsions électriques à haute tension appliquées à travers la membrane cellulaire provoquent une accumulation de charge différentielle de chaque côté de la membrane, augmentant le potentiel transmembranaire, la tension à travers la membrane cellulaire.
Lorsque le potentiel transmembranaire induit dépasse le potentiel de dégradation de la bicouche lipidique, la bicouche lipidique se déstabilise avec le changement de configuration localisé, formant des pores hydrophiles transitoires sur la membrane cellulaire. Les pores de taille adéquate fournissent une voie d’entrée à l’ADN plasmidique dans le cytoplasme cellulaire.
À la fin de l’électroporation, la bicouche lipidique se referme, restaurant l’intégrité de la bicouche de la membrane cellulaire, piégeant ainsi l’ADN plasmidique. De plus, pendant la phase du cycle cellulaire lorsque la membrane nucléaire, la membrane à double couche entourant le noyau, se désassemble, l’ADN plasmidique se déplace vers le noyau.
Placez des cellules électroporées dans des puits contenant des milieux d’une plaque multipuits avec des lamelles recouvertes de protéines. Incuber pour permettre aux cellules d’adhérer à la lamelle enrobée de protéines. Les cellules transfectées avec succès contenant de l’ADN plasmidique expriment les protéines fluorescentes.
Pour commencer, ajoutez 0,5 millilitre de milieu de culture dans chaque paroi de la plaque de culture à 24 puits contenant des lamelles enrobées, et maintenez-la chaude à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone. Pipeter le nombre requis de cellules dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 millilitre et faire tourner à 200 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille de cellule dans 200 microlitres d’Opti-MEM. Répétez cette procédure deux fois pour vous assurer qu’il n’y a pas de milieu de culture résiduel dans le tube. Réglez les paramètres d’électroporation comme indiqué. Pipetez doucement la réaction d’électroporation pour bien mélanger, et utilisez une longue pointe de pipette P200 pour transférer un volume exact de 100 microlitres du mélange dans la cuvette à deux millimètres d’espace.
Une fois que la cuvette est à l’intérieur de la chambre de la cuvette, appuyez sur le bouton oméga de l’électroporateur, et notez la valeur d’impédance en adhérant à un volume précis de 100 microlitres. La plage des valeurs d’impédance doit être d’environ 30 et 35.
Appuyez sur le bouton Start pour lancer l’impulsion. Enregistrez les valeurs de courant mesurées et les rubis indiqués sur le cadre de lecture. Retirez la cuvette de la chambre.
Ajoutez immédiatement 100 microlitres de milieu de culture préchauffé dans la cuvette et remettez-le en suspension en le pipetant de haut en bas deux à trois fois. Transférez immédiatement la suspension cellulaire sur la plaque à 24 puits préalablement préparée. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone.