Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 3:31 min • July 8th, 2025
L’administration de gènes lentiviraux assistée par laser est une technique permettant de transférer un transgène dans un système hôte.
Pour produire des souris transgéniques, commencez par des œufs de souris fécondés isolés dans un milieu de culture approprié. Placez la boîte de culture contenant l’œuf fécondé sur une platine de microscope préinstallée avec un appareil laser et reliée à un logiciel de contrôle. Observez à un grossissement approprié.
Les ovules fécondés sont entourés d’une zone pellucide, une couche protectrice de glycoprotéines qui bloque les particules lentivirales. Pour pénétrer cette barrière, allumez l’appareil laser et assurez-vous que la LED laser est visible au-dessus de la zone pellucide. À l’aide du logiciel de contrôle, tirez le laser. Ajustez la durée de cuisson en fonction du diamètre de perforation souhaité.
Placez les œufs dans un incubateur pour les récupérer. Après une brève incubation, retirez les œufs et ajoutez des particules de lentivirus portant le gène d’intérêt et un marqueur fluorescent sélectionnable.
Avec la zone pellucide perforée, le lentivirus se diffuse facilement vers la membrane de l’ovule et pénètre par endocytose. Le lentivirus se désassemble, libérant son ARN qui, lorsqu’il est transformé séquentiellement en un ADN double brin, pénètre dans le noyau de l’hôte, intégrant les gènes étrangers dans le génome de l’hôte.
Incuber les œufs et les laisser se développer en blastocystes. Implantez les blastocystes dans des souris femelles accouplées. Une fois la gestation terminée, récupérez les petits et analysez-les pour détecter la présence de transgènes.
Pendant que les œufs sont dans l’incubateur, installez et calibrez le laser XYClone selon les recommandations du fabricant. Lorsque les œufs sont prêts, placez la première plaque de chute sur la platine du microscope laser et faites la mise au point manuelle de la zone pellucide. Après avoir vérifié que la lumière LED laser est visible à travers l’objectif, déplacez la platine du microscope pour cibler la zone avec le laser LED et utilisez le logiciel de l’ordinateur pour régler le laser XYClone sur 250 microsecondes.
Ajustez la taille de la lumière LED aux dimensions appropriées et perforez la zone pellucide de chaque œuf trois fois avec le laser pour produire trois trous de 10 micromètres.
Il est essentiel d’effectuer la perforation rapidement mais soigneusement, car les ovules fécondés ne peuvent pas rester à l’extérieur de l’incubateur pendant plus de 15 minutes.
Ensuite, remettez les œufs perforés dans l’incubateur pendant encore deux heures. À la fin de la deuxième incubation, traitez la goutte de KSOM de 50 microlitres avec 2 microlitres de lentivirus concentré sans mélanger, et remettez les œufs dans l’incubateur pendant quatre jours. Lorsque les ovules se sont développés en blastocystes, utilisez un dispositif de transfert d’embryons non chirurgical pour déposer environ 10 à 15 embryons dans environ 2 microlitres de KSOM.
17 jours après le transfert d’embryons, laissez la souris enceinte accoucher naturellement ou récupérez les nouveau-nés par césarienne si nécessaire.