Transduction de gènes médiée par rétroviral : Technique de transfert de gènes permettant d’administrer un transgène dans des cellules en culture à l’aide de vecteurs rétroviraux modifiés

Pour transduire des cellules hôtes avec de l’ARN contenant des vecteurs rétroviraux, prélevez un tube contenant des vecteurs emballés dans un milieu approprié. Chaque vecteur contient une capside virale, contenant le complément d’ARN du transgène à intégrer dans le génome de l’hôte et des enzymes virales importantes. Une bicouche lipidique entoure la capside pour faciliter l’entrée dans la cellule hôte.

Ajouter les vecteurs en présence d’un réactif de transfection approprié dans le puits d’une plaque de culture contenant la suspension de la cellule hôte. Couvrez l’assiette. Centrifugeuse à basse vitesse pour permettre la transduction de l’essorage. Cela rapproche le vecteur viral de la surface de la cellule hôte, augmentant ainsi l’efficacité de la transduction.

Simultanément, les polycations du réactif de transfection neutralisent les charges négatives sur le virus et la cellule hôte, favorisant l’adsorption virale sur les cellules cibles.

Par conséquent, les récepteurs à la surface du virus facilitent sa fusion avec la membrane de l’hôte. La capside virale pénètre dans la cellule et se rompt, libérant de l’ARN transgénique et des enzymes virales dans son cytoplasme.

À l’intérieur du cytoplasme, la transcriptase inverse virale convertit l’ARN en un ADN complémentaire simple brin, le transformant ensuite en ADN proviral double brin. L’ADN qui en résulte pénètre dans le noyau. L’enzyme intégrase virale médie l’intégration de l’ADN proviral dans le génome de l’hôte, ce qui entraîne des cellules transduites.

Prélever le surnageant viral frais de la lignée cellulaire du producteur viral. À ce stade, les cellules doivent être bien espacées avec une morphologie définie. Ensuite, aspirez soigneusement les 2 premiers millilitres de milieu de chaque puits de la plaque à 6 puits contenant les cellules de la moelle osseuse. Évitez d’aspirer les cellules de la moelle osseuse qui sont généralement concentrées au milieu du puits.

Ajoutez 3 millilitres de surnageant viral fraîchement supplémenté dans chaque puits de la plaque à 6 puits contenant les cellules de la moelle osseuse. Après avoir enveloppé les plaques dans du plastique, répétez la transduction de spin, puis placez les plaques non emballées dans l’incubateur de culture tissulaire. Après 24 heures le troisième jour, retirez et remplacez 2 millilitres de média des puits.