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Techniques biologiques
0 vues • 2:44 min • July 8th, 2025
La stéatose hépatique est une affection pathologique caractérisée par une accumulation excessive de graisses dans les hépatocytes - un type de cellules hépatiques proéminent. Les graisses se déposent sous forme de gouttelettes lipidiques de tailles variables dans le cytoplasme des hépatocytes.
Structurellement, une gouttelette lipidique contient un noyau de graisses neutres et hydrophobes telles que les triglycérides et les esters de cholestérol. Le noyau est entouré d’une monocouche de phospholipides décorée de diverses protéines.
Pour visualiser le dépôt de graisse, prenez une plaque multi-puits contenant une culture d’hépatocytes adhérente. Les cellules sont prétraitées avec un milieu stéatogène pour induire l’accumulation de gouttelettes lipidiques à l’intérieur de celles-ci.
Ajoutez la concentration souhaitée de paraformaldéhyde, qui se diffuse dans les cellules et réticule, les protéines. Cette étape désactive les protéases et préserve la structure hépatocytaire. Jetez le paraformaldéhyde et ajoutez la solution Oil-red-O contenant le colorant organique dissous dans l’isopropanol.
L’isopropanol agit comme un solvant porteur pour les molécules Oil-red-O, peu solubles. Cela aide les molécules de colorant à pénétrer dans les hépatocytes fixes et finalement à atteindre les gouttelettes lipidiques. Une fois à l’intérieur, le colorant passe de l’isopropanol aux lipides neutres en raison de sa plus grande affinité, formant le complexe colorant-lipide. Cela se traduit par une coloration rouge des gouttelettes lipidiques.
Jetez l’excès de colorant et observez les cellules au microscope. Les gouttelettes lipidiques intracellulaires apparaissent intensément rouges.
Placez une lamelle de culture cellulaire dans chaque puits d’une plaque à 24 puits et ensemencez des cellules HepG2, comme décrit dans le manuscrit du texte. Après l’incubation appropriée, lavez les cellules avec 1 millilitre de PBS et jetez le surnageant. Fixez-les avec 1 millilitre de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS et incubez pendant 1 heure à température ambiante. Jetez l’excès de paraformaldéhyde et rincez les cellules avec 1 millilitre d’eau distillée.
Ensuite, ajoutez 1 millilitre d’isopropanol à 70 % et laissez incuber pendant 5 minutes. Jetez l’excès d’isopropanol et ajoutez 1 millilitre de solution O rouge huile, et incubez pendant 30 minutes. Jetez l’excès de solution Oil-Red O, puis rincez avec 1 millilitre d’eau distillée. Observez les cellules au microscope à un grossissement de 400x.