Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 3:10 min • July 8th, 2025
Les cellules musculaires lisses vasculaires, ou VSMC, sont les composants cellulaires proéminents de la tunique moyenne - la couche intermédiaire de la paroi des vaisseaux sanguins. En réponse à des signaux pathologiques ou au vieillissement, ces cellules interviennent dans la calcification vasculaire - un phénomène d’accumulation de calcium dans la matrice extracellulaire.
Prenez une plaque multi-puits contenant une couche adhérente de culture VSMC aortique murine précalcifiée. Incuber les cellules avec une solution de formol pour réticuler les protéines cellulaires et stabiliser la structure VSMC avant la coloration.
Commencez la coloration de von Kossa en aspirant du formol du puits et en ajoutant une solution de nitrate d’argent. Incuber la plaque sous une source lumineuse appropriée.
Une fois que la solution de nitrate d’argent atteint les sites de calcification dans la matrice extracellulaire de la couche VSMC, les ions argent remplacent les ions calcium liés au phosphate. Il en résulte une coloration jaune transitoire. En présence de matière organique et de lumière, la dégradation photochimique du phosphate d’argent entraîne la formation d’argent métallique de couleur noire.
Jetez la quantité maximale de solution de nitrate d’argent épuisée. Traitez les cellules avec une solution de thiosulfate de sodium. Cette solution convertit les sels d’argent résiduels en un complexe soluble dans l’eau, qui peut être éliminé par un rinçage final à l’eau, améliorant ainsi le contraste des taches.
Imagez les cellules colorées pour localiser les dépôts noirs insolubles indiquant une calcification.
Pour induire la calcification dans les cellules musculaires lisses vasculaires, transférez les cellules dans la plaque de culture à six puits et laissez-les adhérer. Ensuite, réalimentez les cellules dans un milieu de calcification. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant au moins sept jours. Ensuite, aspirez le milieu de la plaque de culture cellulaire. Lavez les cellules une fois dans de l’eau déminéralisée.
Fixez les cellules en les plaçant dans 1 millilitre de formol à 10 % à température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, retirez le formol et lavez les cellules fixées avec de l’eau distillée pendant 5 minutes.
Ensuite, incubez les cellules dans 1 millilitre de solution de nitrate d’argent à 5 % sous une ampoule de 60 à 100 watts pendant 1 à 2 heures. Ensuite, aspirez la solution de nitrate d’argent et lavez-vous à l’eau distillée pendant 5 minutes. Après 5 minutes, retirez l’argent qui n’a pas réagi en plaçant les cellules dans 1 millilitre de solution de thiosulfate de sodium à 5 % dans de l’eau distillée pendant 5 minutes. Ensuite, rincez les cellules à l’eau distillée pendant 5 minutes. Les cellules colorées avec von Kossa sont maintenant prêtes pour l’imagerie par microscopie à lumière inversée standard.