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Techniques biologiques
0 vues • 3:14 min • July 8th, 2025
Pour une coloration spécifique au cytoplasme cellulaire dans les microenvironnements des tissus mous, obtenez un rein de souris fraîchement récolté. Traitez-le avec une solution fixatrice contenant du formaldéhyde, de l’acide acétique glacial et du méthanol. Incuber à basse température.
Le formaldéhyde pénètre dans les cellules, réticulant les protéines avec les protéines et les protéines avec les acides nucléiques. Le méthanol déplace l’eau des tissus et coagule les protéines. L’acide acétique provoque une acidification intracellulaire et un gonflement des tissus, contrecarrant ainsi le rétrécissement des tissus causé par le méthanol.
La fixation inactive les enzymes et stabilise la morphologie des tissus pour la coloration ultérieure. Retirez l’excès de fixateurs à l’aide d’un tampon. Incuber le tissu avec de l’éosine Y, un colorant acide.
L’éosine pénètre dans les cellules fixes et pénètre dans le cytoplasme. L’environnement acide du cytoplasme, issu du traitement à l’acide acétique, provoque une protonation maximale des groupes aminés des protéines cytoplasmiques.
L’éosine, avec des groupes fonctionnels chargés négativement, interagit électrostatiquement avec les groupes protonés de protéines, formant un complexe colorant-protéine stable, et colore le cytoplasme en rose lors de l’accumulation. Après l’incubation, coupez le rein coloré en petits morceaux, suivi d’une déshydratation tissulaire en augmentant les concentrations d’éthanol.
Incorporez le tissu rénal dans de la cire de paraffine. Obtenez des coupes de tissus minces à l’aide d’un microtome. De plus, réhydratez les sections pour l’analyse microscopique.
Les noyaux cellulaires non colorés apparaissent blancs sur un cytoplasme coloré en rose, ce qui permet de visualiser des microstructures rénales telles que des tubules convolutés proximaux, comprenant des cellules épithéliales avec des bordures en brosse, ou des canaux collecteurs, qui sont tapissés de cellules épithéliales aplaties sans bordures en brosse.
Commencez par fixer les échantillons de tissus mous. Remplissez un tube à centrifuger de 50 millilitres avec une solution fixatrice contenant 9,5 millilitres de formaldéhyde à 4 % et 0,5 millilitre d’acide acétique glacial. Ajoutez l’échantillon de tissus mous dans le tube à centrifuger et réfrigérez-le pendant 24 à 72 heures.
Après la réfrigération, laver l’échantillon de tissus mous avec la solution DPBS pendant 1 heure. Ensuite, colorez l’échantillon en le plaçant dans 2 millilitres de solution de coloration à l’éosine Y, et incubez-le sur une plaque d’agitation horizontale pendant 24 heures.
Le lendemain, sortez soigneusement l’échantillon de tissus mous du récipient d’échantillon et retirez l’excès de colorant avec du papier de soie en cellulose. Placez-le dans un récipient conique au-dessus d’une phase de vapeur d’éthanol pour le stockage et l’utilisation ultérieure.