Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 4:33 min • July 8th, 2025
Au cours des métastases cancéreuses, les cellules tumorales d’une tumeur primaire se déplacent dans le système circulatoire, extravasent vers des organes distants et établissent des tumeurs secondaires.
Pour évaluer les métastases pulmonaires dans un modèle murin de cancer du sein auquel on a injecté des cellules 4T1, des cellules cancéreuses du sein hautement métastatiques, préparez une suspension cellulaire, comprenant des cellules 4T1, isolées des poumons prélevés. Centrifuger la suspension et remettre les cellules en suspension dans un milieu contenant de la 6-thioguanine, 6-TG - un analogue de la guanine. Grainez la suspension cellulaire dans une plaque de culture.
La 6TG pénètre dans les cellules normales où une enzyme transférase spécifique la convertit en nucléotide 6-TG, un nucléotide toxique. Ces nucléotides cytotoxiques sont incorporés dans l’ADN, causant des dommages à l’ADN et éliminent sélectivement les cellules de la culture. Les cellules 4T1 ont une capacité réduite à former des nucléotides toxiques, ce qui facilite leur survie et leur adhérence à la plaque. En fonction de la capacité proliférative des cellules, elles forment des colonies.
Traitez les cellules avec du méthanol. Le méthanol perméabilise les cellules et dénature les protéines cellulaires. Incuber les cellules avec du bleu de méthylène.
Le colorant chargé positivement pénètre dans la cellule, interagit avec l’ADN chargé négativement, s’intercalant dans les espaces entre les paires de bases adjacentes des brins d’ADN. Il se lie également à l’ARN dans le cytoplasme, mais avec une affinité plus faible. Les noyaux se colorent en bleu foncé en raison de la forte concentration d’ADN par rapport au cytoplasme en raison de la faible concentration d’ARN. Les colonies métastatiques apparaissent sous forme de points bleus.
Imagez la plaque. Utilisez un logiciel pour déterminer les colonies métastatiques, en quantifiant la charge métastatique dans les poumons de la souris.
Portez le volume du tube à 10 millilitres avec 1X HBSS. Ensuite, versez le contenu sur une passoire à cellules de 70 micromètres dans le tube conique de 50 millilitres. À l’aide du piston d’une seringue de 1 millilitre, broyez doucement l’échantillon à travers la passoire.
Centrifugez le tube pendant 5 minutes à 350 fois g et jetez le surnageant. Lavez ensuite le granulé deux fois avec 10 millilitres de 1X HBSS. Remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de 60 micromolaires de milieu de culture complet de 6-Thioguanine, et plaquez les échantillons dans les plaques de culture cellulaire de 10 centimètres en utilisant un schéma de dilution, si vous le souhaitez.
Incuber les plaques à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 5 jours. Versez le milieu de culture des plaques dans le conteneur à déchets approprié. Pour fixer les cellules, ajoutez 5 millilitres de méthanol non dilué dans chaque plaque et incubez pendant 5 minutes à température ambiante, en veillant à faire tourner le méthanol de manière à ce qu’il recouvre toute la plaque.
Versez le méthanol des plaques dans le récipient à déchets approprié, puis rincez chaque plaque avec 5 millilitres d’eau distillée. Ajoutez 5 millilitres de bleu de méthylène à 0,03 % par assiette et incubez-la pendant 5 minutes à température ambiante, en veillant à faire tourner la solution de bleu de méthylène de manière à ce qu’elle recouvre toute la plaque. Versez le bleu de méthylène dans le récipient à déchets approprié et rincez à nouveau chaque assiette avec 5 millilitres d’eau distillée.
Retournez l’assiette et épongez-la contre une serviette en papier pour éliminer l’excès de liquide. Placez l’assiette sur son couvercle et laissez-la sécher à l’air libre pendant la nuit. Les colonies métastatiques seront bleues. Une fois que les plaques ont séché, elles peuvent être conservées indéfiniment à température ambiante.