Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 2:50 min • July 8th, 2025
Les nerfs périphériques sont constitués d’axones entourés de cellules de Schwann qui s’enroulent autour des axones avec plusieurs couches de membranes cellulaires riches en lipides, formant la gaine de myéline.
Pour visualiser les nerfs périphériques, commencez par une lame de verre portant une section transverse de nerf périphérique de rat de rat fixe, incorporée dans de la résine et traitée au tétroxyde d’osmium. Les sections incrustées de résine aident à maintenir la morphologie des tissus.
Letraitement au tétroxyde d’osmium provoque le dépôt d’osmium métallique dans la couche lipidique de la gaine de myéline au site tissulaire.
Pipeter une solution alcaline de bleu de toluidine sur la section du tissu. Séchez la lame à une température appropriée. Les conditions alcalines et la chaleur facilitent la pénétration du bleu de toluidine à travers la résine dans la section du tissu.
Le bleu de toluidine, étant un colorant cationique, se lie aux groupes phosphate chargés négativement sur l’ADN et intercalé également entre les paires de bases de l’ADN dans les noyaux des cellules de Schwann. De plus, le colorant se lie à l’ARN dans le cytoplasme, à l’extérieur de la gaine de myéline.
Ajoutez une solution de montage sur la section nerveuse colorée et recouvrez d’une lamelle pour préparer le tissu à l’imagerie. Au microscope optique, les couches de gaine de myéline apparaissent noires avec des structures de fibres nerveuses myélinisées définies après un traitement à l’osmium, tandis que les axones restent non colorés.
Les noyaux et le cytoplasme des cellules de Schwann apparaissent différentes nuances de bleu en raison de la propriété métachromatique du colorant, facilitant la visualisation de la morphologie axonale et du degré de myélinisation dans les nerfs périphériques.
Pour colorer les sections nerveuses, utilisez une pipette en plastique ou une micro-pipette pour ajouter une goutte de solution de bleu de toluidine sur le dessus des sections nerveuses. Après 20 à 30 secondes, rincez tout l’excès de solution de bleu de toluidine en trempant doucement les lames dans un bocal d’eau déminéralisée, en répétant 3 à 4 fois jusqu’à ce que les sections soient claires.
Faites sécher les lames pendant au moins 15 minutes à 60 degrés Celsius, ou toute la nuit à température ambiante. Après séchage, ajoutez un support de montage régulier et recouvrez les sections avec une lamelle. Enfin, examinez les sections montées au microscope optique. Un objectif à immersion dans l’huile 100X est recommandé pour des images détaillées afin de calculer les rapports g.