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Techniques biologiques
0 vues • 3:32 min • July 8th, 2025
Dans une population hétérogène de cellules tumorales, le traitement avec un médicament anticancéreux tuerait la plupart des cellules, mais les cellules résistantes aux médicaments survivent, entraînant un échec thérapeutique.
Pour déterminer la proportion de cellules résistantes aux médicaments, ensemencez une population de cellules tumorales hétérogènes dans une plaque multi-puits. Incuber pour faciliter l’adhésion cellulaire. Ajouter une concentration croissante d’une solution médicamenteuse anticancéreuse appropriée.
L’interaction avec les molécules médicamenteuses provoque la mort des cellules sensibles et, par la suite, leur détachement des plaques de culture. En revanche, les cellules résistantes aux médicaments survivent et restent attachées à la plaque.
Aspirez le support usé pour retirer les cellules détachées. Ajoutez un milieu frais sans médicament et incubez la plaque dans des conditions physiologiques. Les cellules résistantes aux médicaments prolifèrent et forment des colonies tumorales. Maintenant, ajoutez une solution de coloration violette cristalline aux colonies et incuber.
Le violet cristallin, une coloration de couleur violette, perméable à la membrane et chargée positivement, pénètre dans les cellules et lie les protéines anioniques et l’ADN, conférant ainsi une couleur violette aux cellules.
Ensuite, ajoutez de l’éthanol pour solubiliser la coloration qui n’a pas réagi. Lavez pour enlever toute tache en excès et faites sécher la plaque à l’air.
Les colonies résistantes aux médicaments apparaissent sous forme de points violets. Comptez le nombre de colonies colorées dans chaque puits. Représenter le pourcentage de viabilité cellulaire sur un graphique pour déterminer la proportion de cellules cancéreuses résistantes aux médicaments à chaque concentration de médicament.
Dans cette procédure, plaquez 2000 cellules, en utilisant 2 millilitres de média par puits, dans les plaques à 6 puits. Après 24 heures, ajoutez des concentrations croissantes de Docétaxel pour les lignées cellulaires DU145 et 22Rv1. Ajouter du DMSO uniquement à un puits en tant que témoin au même volume que celui utilisé pour la dose la plus élevée de Docétaxel.
Après 72 heures, aspirez le milieu contenant du médicament et ajoutez un milieu frais sans Docétaxel. Incuber les plaques pendant une à deux semaines, jusqu’à ce que les colonies soient visibles au microscope.
Pour colorer les colonies, lavez-les délicatement avec 2 à 3 millilitres de PBS, et incubez-les avec deux à trois millilitres de solution de violet cristallin pendant 20 minutes, à l’intérieur de la hotte de culture tissulaire ou d’une hotte. Ensuite, retirez la solution de coloration et lavez les plaques avec 2 à 3 millilitres d’eau. Ensuite, retirez l’eau et faites sécher les plaques à l’air.
Prenez des images numériques des plaques pour la représentation de figures. Analysez le résultat en visualisant les puits et en comptant manuellement les colonies à l’aide d’un marqueur.