Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 3:37 min • July 8th, 2025
Les œnocytes larvaires de la drosophile sont des cellules spécialisées qui se fixent sous la forme de grappes discrètes sur la surface basale de l’épiderme latéral - la couche superficielle de la peau. Ces œnocytes sont principalement impliqués dans le métabolisme des lipides.
Pendant la famine, ces œnocytes accumulent des gouttelettes lipidiques en excès. Chaque gouttelette est constituée d’un noyau hydrophobe de lipides neutres, tels que les triglycérides, et les esters de cholestérol, entouré d’une monocouche de phospholipides.
Pour visualiser les gouttelettes lipidiques, prélever une coupe disséquée de l’épiderme larvaire de la drosophile avec les œnocytes attachés. Traiter avec un tampon de fixation contenant du paraformaldéhyde pour réticuler les protéines cellulaires comme les protéases et préserver l’intégrité structurelle des œnocytes. Retirez le tampon de fixation. Incuber avec un colorant fluorescent à base de BODIPY dans l’obscurité pour éviter le photoblanchiment.
Pendant l’incubation, le colorant non polaire se diffuse à travers la membrane cellulaire des œnocytes et traverse la monocouche entourant les gouttelettes lipidiques. L’hydrophobicité des molécules de colorant permet à celles-ci de se déplacer dans le noyau non polaire des gouttelettes lipidiques pour se lier aux lipides neutres.
Montez l’échantillon sur une lame, les œnocytes touchant la lame microscopique pour une visualisation claire. Scellez l’échantillon à l’aide d’une lamelle et observez au microscope à fluorescence.
Lors de l’excitation par la lumière bleue à une longueur d’onde de quatre quatre-vingt-treize nanomètres, le colorant émet une fluorescence verte à cinq cent trois nanomètres. Des taches fluorescentes vertes confirment la présence de gouttelettes lipidiques.
Pour la coloration par gouttelettes lipidiques, incuber l’épiderme disséqué dans un tampon de fixation, pendant 30 minutes à température ambiante sur un rotateur, suivi d’une remise en suspension rapide dans 1 millilitre de PBS. Ensuite, lavez les échantillons avec trois lavages de 5 minutes dans 1 millilitre de PBS par lavage, pour éliminer tout fixateur résiduel.
Après le dernier lavage, incubez les échantillons épidermiques à l’aide d’une sonde lipophile appropriée pendant 30 minutes à température ambiante sur un rotateur. Pendant l’incubation, enveloppez les tubes d’échantillon dans une feuille d’aluminium pour protéger les tissus de la lumière, et lavez les échantillons trois fois dans 1 millilitre de PBS pendant 10 minutes par lavage.
Pour imager les œnocytes, transférez chaque échantillon d’épiderme dans 6 microlitres de milieu de montage sur une lame de microscope propre. Ajustez l’orientation du tissu de manière à ce que la surface interne contenant les œnocytes touche le bas de la lame. Placez délicatement une lamelle sur l’épiderme et scellez les bords avec du vernis à ongles transparent. Lorsque le vernis a séché, imagez les échantillons sur un microscope confocal à un grossissement de 63X avec les longueurs d’onde d’excitation et d’émission appropriées.