Coloration à la phosphatase acide résistante au tartrate : une technique in vitro pour détecter les ostéoclastes cultivés contenant l’enzyme TRAP

Les ostéoclastes sont de grandes cellules multinucléées en forme de dôme situées à la surface de l’os. Ces cellules contiennent de nombreux granules cytoplasmiques riches en phosphatase acide résistante au tartrate, ou TRAP - une enzyme métalloprotéique sécrétée par le bord ébouriffé des ostéoclastes dans le tissu osseux. Cette enzyme digère la matrice extracellulaire et dissout les cristaux minéraux, facilitant ainsi la résorption osseuse.

Pour détecter les granules TRAP en tant que marqueurs cytochimiques des ostéoclastes, prenez une boîte de culture contenant des ostéoclastes adhérents. Ajouter la solution de coloration TRAP dans les cellules. Cette solution comprend le substrat - un dérivé de naphtol contenant du phosphate et de l’acide tartrique dans un tampon complété par un sel de diazonium.

Ajoutez de l’acide acétique à cette solution pour maintenir le pH acide nécessaire à la coloration TRAP. Incuber les cellules dans l’obscurité à une température physiologique pour une activité enzymatique TRAP optimale.

La solution de coloration pénètre dans les ostéoclastes, où l’acide tartrique inhibe l’activité hydrolysante des phosphatases acides sensibles au tartrate dans d’autres cellules.

Dans le même temps, TRAP hydrolyse le substrat ajouté pour éliminer son groupe phosphate. Le substrat hydrolysé se couple avec un sel de diazonium de la solution de coloration pour former un complexe de colorant insoluble de couleur marron. Ce complexe précipite sous forme de granules sur les sites d’activité enzymatique.

Imagez les cellules au microscope. Le dépôt de granules de colorant marron à l’intérieur du cytoplasme confirme la présence d’ostéoclastes contenant du TRAP dans la culture.

Dans cette étape, aspirez le milieu et lavez doucement l’échantillon trois fois avec 1X PBS. Ensuite, fixez les cellules dans chaque puits de la plaque de 96 puits avec 100 microlitres de solution fixe pendant 30 secondes à température ambiante.

Après la fixation, aspirez la solution fixe et lavez doucement les cellules trois fois avec de l’eau désionisée, préchauffée à 37 degrés Celsius. Ensuite, aspirez l’eau déminéralisée et ajoutez 100 microlitres de colorant TRAP dans chaque puits de la plaque à 96 puits.

Placez l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes et mettez-la à l’abri de la lumière. Après la coloration, aspirez la tache TRAP et lavez-la doucement trois fois avec de l’eau déminéralisée. Par la suite, imagez les ostéoclastes au microscope inversé à un grossissement de 40X.