JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniques biologiques
0 vues • 3:37 min • July 8th, 2025
Les ostéoblastes sont des cellules osseuses qui sécrètent de petites vésicules dans leur matrice extracellulaire, la MEC. Ces vésicules, appelées vésicules matricielles, sont équipées de transporteurs membranaires et d’enzymes qui permettent l’entrée des ions calcium et phosphate, formant des cristaux minéraux à l’intérieur. Au fur et à mesure que les cristaux s’accumulent, ils percent la membrane de la vésicule pour former des nodules minéralisés dans l’ECM, constituant la densité minérale osseuse.
Pour visualiser la minéralisation, commencez avec des cellules ostéoblastiques sur un échafaudage biocompatible dans un milieu de croissance approprié. Les ostéoblastes se fixent à l’échafaudage et utilisent les facteurs de croissance du milieu pour sécréter des vésicules matricielles qui forment par la suite des nodules minéralisés dans la MEC.
Aspirez le milieu de culture et rincez les cellules pour éliminer toute trace de milieu. Traitez les cellules avec une solution de formol, qui induit la réticulation, la fixation et la préservation de la structure tissulaire de la MEC. Lavez les cellules pour éliminer tout formol restant.
Ensuite, ajoutez la solution de coloration au rouge d’alizarine et incubez la culture. Les molécules de colorant se lient au nodule minéralisé et s’associent au calcium, un minéral osseux clé, formant de grands complexes colorés.
Aspirez la solution de coloration et lavez-la soigneusement pour éliminer tout colorant non lié. Lorsqu’ils sont observés au microscope, les dépôts minéraux riches en calcium apparaissent sous forme de nodules rouge vif dans l’ECM, indiquant une minéralisation par les ostéoblastes.
Milieu de culture aspiré à partir d’ostéoblastes primaires, 14 jours après l’ajout du milieu de minéralisation ostéogénique. Rincez deux fois avec 0,5 millilitre de 1X PBS. Ensuite, fixez les cellules en ajoutant 0,5 millilitre de solution de formol tamponnée à 10 % et en incubant à température ambiante pendant 10 minutes. Après 10 minutes, aspirez le formol tamponné à 10 % avec une pipette à usage unique et lavez-le deux fois avec 0,5 millilitre d’eau ultrapure. Ensuite, ajoutez 250 microlitres de solution de coloration rouge d’alizarine S de 40 millimolaires aux ostéoblastes fixés, et incubez la plaque à température ambiante pendant 10 minutes sur un agitateur à raison de 100 secousses par minute.
Après l’incubation avec une solution de coloration, aspirez la solution de coloration à l’aide d’une pipette à usage unique et rincez avec 1 millilitre d’eau ultrapure. Répétez cette étape 5 à 10 fois jusqu’à ce que la solution de rinçage se détache claire pour éliminer les taches non spécifiques. Après avoir aspiré le lavage final, ajoutez 1 millilitre de PBS froid et incubez la plaque à température ambiante pendant 10 minutes sur un shaker comme précédemment. Ensuite, transférez le disque de phosphate bêta-tricalcique coloré dans un nouveau puits et scannez les plaques avec un scanner à plat pour enregistrer la minéralisation.