Coloration à l’argent des glycosaminoglycanes sulfatés : une méthode de coloration pour la visualisation des glycosaminoglycanes sulfatés dans des gels de polyacrylamide

Les glycosaminoglycanes sulfatés, GAG, sont de longs polysaccharides linéaires, chargés négativement, avec des chaînes d’unités disaccharides répétitives sulfatées à des positions distinctes, existant en longueurs variables.

Pour visualiser des GAG sulfatés isolés d’intérêt variant en longueur de chaîne dans un gel de polyacrylamide après électrophorèse, retirez soigneusement le gel de sa cassette. Rincez à l’eau déminéralisée, en enlevant les morceaux de gel attachés qui pourraient interférer avec les taches.

Traiter avec une solution acide de bleu d’Alcian. Dans des conditions acides, le bleu alcien, un colorant cationique polyvalent avec un atome de cuivre au centre, interagit spécifiquement avec les GAG sulfatés chargés négativement via des interactions ioniques, formant un complexe insoluble dans l’eau d’un bleu profond.

Lavez le gel avec de l’eau déminéralisée et du méthanol, en éliminant toute tache résiduelle. Incuber le gel avec une solution alcaline de nitrate d’argent. Dans des conditions alcalines, les GAG sulfatés liés au bleu d’Alcian fournissent des sites pour que les ions d’argent chargés positivement se lient et forment des complexes.

Traitez le gel dans une solution en développement contenant du formaldéhyde et de l’acide citrique. L’acide citrique abaisse le pH local pour une activité optimale du formaldéhyde, ce qui réduit les ions d’argent en argent métallique insoluble dans les fragments de GAG sulfatés, amplifiant ainsi le signal bleu d’Alcian.

Ajoutez une solution d’arrêt pour abaisser le pH, empêchant la réduction des ions d’argent pour une coloration de fond minimale. Maintenant, imaginez le gel.

Les

bandes de fragments de GAG sulfatés teintés en bleu d’argent alcian apparaissent brun foncé ou noir, ce qui permet une visualisation et une détermination à haute sensibilité des longueurs de chaîne polymère GAG isolées.

Une fois le cycle terminé, démontez la cassette et extrayez soigneusement le gel dans un grand récipient propre rempli d’eau déminéralisée et filtrée. Ensuite, jetez l’eau et colorez le gel dans une solution de coloration au bleu d’Alcian pendant cinq minutes. Jetez la tache de bleu d’Alcian et lavez-la rapidement deux à trois fois avec de l’eau déminéralisée et filtrée jusqu’à ce que la majeure partie de la solution de coloration au bleu d’Alcian ait été éliminée.

Teindre le gel dans une solution de coloration au nitrate d’argent dans un récipient frais et propre pendant 30 minutes. Ensuite, lavez deux à trois fois pendant 30 minutes chacune dans de l’eau filtrée déminéralisée, pour éliminer complètement la solution de coloration argentée. Jetez l’eau et ajoutez la solution de développement.

Observez attentivement le gel pour l’apparition de bandes. En fonction de la qualité de la coloration et de la masse de l’échantillon chargé, le développement peut prendre de quelques secondes à plusieurs minutes. Dès que les bandes souhaitées sont visibles, jetez immédiatement la solution en développement et lavez brièvement le gel avec une solution d’arrêt.