Coloration de Giemsa pour le test de formation de colonies : une procédure de coloration in vitro pour évaluer la capacité de prolifération des cellules souches mésenchymateuses
JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniques biologiques
0 vues • 2:52 min • July 8th, 2025
Les tests de formation de colonies mesurent la capacité proliférative des cellules à se développer en colonies.
Tout d’abord, une suspension cellulaire dérivée de la moelle osseuse comprenant des érythrocytes et des cellules mononucléaires, y compris des cellules souches mésenchymateuses ou CSM, dans des milieux sur une plaque de culture et incubée. Les CSM adhèrent au fond de la plaque tandis que les érythrocytes et les cellules mononucléées restent en suspension et sont jetés.
Ajouter des milieux frais contenant des facteurs de croissance pour favoriser la survie des CSM. En fonction de leur potentiel prolifératif individuel, les CSM se répliquent pour former des colonies.
Ensuite, traitez les colonies avec du méthanol. Le méthanol perméabilise les cellules, déplace l’eau de l’environnement intracellulaire et dénature les protéines, préservant ainsi l’architecture cellulaire.
Incuber les colonies fixées avec une solution de coloration Giemsa - un mélange de produits d’oxydation du bleu de méthylène, principalement de l’azur B, un colorant basique, et de l’éosine Y, un colorant acide. Lors de la diffusion dans les cellules, les dimères B azur chargés positivement se lient par intercalation à l’ADN chargé négativement dans le noyau, conférant une coloration bleue.
Les monomères Y de l’éosine chargés négativement interagissent ensuite avec des charges positives non neutralisées sur des dimères B azur liés, formant un « complexe éosine-Y-azure-B », changeant la coloration de l’ADN coloré en violet.
Dans le cytoplasme riche en ribosomes, l’azur B se lie à l’ARN chargé négativement, mais la pénétration réduite de l’éosine Y dans les ribosomes très denses empêche la formation du complexe éosine-Y-azure-B, colorant l’ARN en bleu.
Maintenant, lavez la plaque avec un tampon pour enlever l’excès de tache et séchez-la à l’air. Comptez le nombre de colonies, qui apparaissent comme des amas de cellules avec des noyaux violets et un cytoplasme bleu.
Pour effectuer le dosage de l’UFC, préparer 10 millilitres de solution de Giemsa par plat, en diluant la solution mère 1 à 10 avec de l’eau stérile. Retirez le milieu de la boîte de culture cellulaire et utilisez du PBS pour laver soigneusement les cellules.
Avec du méthanol pur, fixez les cellules à température ambiante pendant 5 minutes, puis jetez le méthanol et ajoutez la solution Giemsa. Incuber dans une chambre humidifiée à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Après l’incubation, utilisez du PBS pour laver les cellules deux fois. Ensuite, faites sécher l’assiette à l’air libre la tête la première sur une serviette en papier. À l’aide d’un marqueur au dos de la plaque, comptez manuellement les colonies.
Aperçu
Cet article décrit le test de formation de colonies, une méthode permettant d'évaluer la capacité proliférative des cellules issues de la moelle osseuse, en particulier des cellules souches mésenchymateuses (MSCs). Le processus consiste à ensemencer des suspensions cellulaires, à les incuber, puis à appliquer une technique de coloration afin de visualiser les colonies formées.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Recherche sur les cellules souches
- Développement de tests
Contexte
- Les tests de formation de colonies sont essentiels pour évaluer la prolifération cellulaire.
- Les CSM sont connues pour leur capacité à se différencier et à proliférer.
- Les techniques de coloration permettent de visualiser les structures cellulaires et d'évaluer la viabilité.
- Comprendre le comportement des CSM est crucial pour les applications thérapeutiques.
Objectif de l'étude
- Démontrer la méthodologie pour réaliser un test de formation de colonies.
- Mettre en évidence l'importance des cellules souches mésenchymateuses en médecine régénérative.
- Fournir un protocole détaillé permettant aux chercheurs de le reproduire.
Méthodes utilisées
- Ensemencement de la suspension de cellules dérivées de la moelle osseuse dans des plaques de culture.
- Incubation pour permettre l'adhérence des cellules souches mésenchymateuses et la formation de colonies.
- Fixation des colonies à l'aide de méthanol pour leur conservation.
- Coloration avec la solution de Giemsa afin de visualiser les colonies.
Résultats principaux
- Formation réussie de colonies observée sous forme d'agglomérats de cellules.
- La coloration permettait de distinguer l'ADN de l'ARN au sein des cellules.
- Le protocole permet un décompte précis des colonies.
- Les résultats visuels démontrent l'efficacité du test.
Conclusions
- Le test de formation de colonies est une méthode fiable pour évaluer la prolifération des CSM.
- Les techniques de coloration améliorent la visualisation des structures cellulaires.
- Cette méthode peut être utilisée dans diverses applications de recherche sur les cellules souches.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'évaluation quantitative de la capacité proliférative des cellules souches mésenchymateuses (CSM) est essentielle pour la validation précoce des cibles et la réduction des risques dans les pipelines de thérapie cellulaire et de médecine régénérative. Le test de formation de colonies colorées par la méthode de Giemsa fournit un indicateur normalisé et reproductible permettant d'évaluer la viabilité et le potentiel d'expansion des CSM, renforçant ainsi la fiabilité prédictive du choix des candidats en phase préclinique. Ce protocole permet une comparaison rigoureuse des populations cellulaires et éclaire les décisions d'avancement ajustées au risque dans les portefeuilles de recherche fondamentale et translationnelle.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet la mesure directe du potentiel prolifératif des CSM pour la validation fonctionnelle des cibles.
- Contribue à l'atténuation des risques biologiques en distinguant les cellules viables formant des colonies des populations non prolifératives.
- Facilite une prédiction fiable des hypothèses thérapeutiques cellulaires et du tri des portefeuilles.
Développement de criblages et de tests
- Établit un dosage quantitatif validé de la formation de colonies de CSM, adapté aux flux de travail de criblage en aval.
- Fournit des résultats reproductibles et standardisés permettant des comparaisons entre conditions et entre lots.
- Permet une évaluation fiable des effets de composés ou de conditions sur la prolifération des CSM.
Recherche translationnelle et préclinique
- Offre un pont entre la découverte in vitro et le choix des modèles précliniques en quantifiant le potentiel d'expansion des cellules souches mésenchymateuses (CSM).
- Permet une continuité translationnelle en associant les paramètres de prolifération in vitro au potentiel d'engraftement in vivo, lorsque cela est pertinent.
- Réduit l'ambiguïté mécanistique dans l'avancement des candidats aux thérapies cellulaires.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le test de formation de colonies coloré à la Giemsa se situe à l'interface entre la découverte précoce et la recherche préclinique, permettant la vérification d'hypothèses et la validation fonctionnelle des CSM avant l'identification de candidats ou des études translationnelles.
- Biologie de la découverte : Quantifie la prolifération des CSM pour soutenir la validation d'hypothèses et la clarification des voies biologiques.
- Écrantage : Fournit des dénombrements normalisés et reproductibles de colonies pour évaluer la préparation des tests et comparer les lots.
- Analytique : Génère des données quantitatives destinées à l'analyse statistique des différences de prolifération selon les conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Guide le choix des modèles précliniques en établissant un lien entre la prolifération in vitro et la performance potentielle in vivo.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme d'essai réutilisable et évolutive pour les programmes continus de recherche et développement sur les CSM.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans les recherches fondées sur les CSM.
- Valeur opérationnelle : Fournit des résultats d'essais standardisés, reproductibles et évolutifs utilisables entre équipes.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions éclairées d'aller/arrêt et une gestion efficace du portefeuille en capital.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation et l'avancement, ajustées au risque, des candidats thérapeutiques cellulaires.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture cellulaire, en protocoles de fixation et de coloration.
- Suppose l'accès à une infrastructure standard de culture tissulaire et de microscopie analytique.
- Exige une standardisation interéquipes du comptage des colonies et de l'interprétation des données.
- Pourrait nécessiter des adaptations selon les sources de CSM ou les systèmes modèles utilisés.
- Le comptage manuel des colonies peut limiter le débit et introduire une variabilité entre opérateurs.
F.A.Q. sur les biopharmaceutiques
Isoler cellules progénitrices Mesangiogenic (PPM) de Human Bone Marrow
Vidéos connexes
0 Vues
Un protocole détaillé pour caractériser la lignée cellulaire murine C1498 et son modèle associé leucémie Souris
Vidéos connexes
0 Vues
Fluorescence interphasique hybridation in situ des frottis de moelle osseuse du myélome multiple
Vidéos connexes
0 Vues
Isolement et animale expansion sans sérum du cordon ombilical humain dérivé cellules stromales mésenchymateuses (CSM) et des cellules endothéliales progénitrices Colony Forming (CPEF)
Vidéos connexes
0 Vues
Colonie de cellules de formage (CFC) Dosage pour les cellules hématopoïétiques humaines
Vidéos connexes
0 Vues
Neural-Formant Colonie dosage cellulaire: Un test pour distinguer Bona Fide Cellules souches neuronales à partir de cellules progénitrices neurales
Vidéos connexes
0 Vues
Caractérisation de cellules souches mésenchymateuses génétiquement modifiées pour des applications neurothérapeutiques
Vidéos connexes
0 Vues
Isolement de mésenchymateuses humaines cellules souches et de leur culture sur la matrice osseuse poreuse
Vidéos connexes
0 Vues
Une méthode enzymatique pour secourir Cellules souches mésenchymateuses à partir d'échantillons coagulés moelle osseuse
Vidéos connexes
0 Vues
Évaluation de la propriétés immunomodulatrices des mésenchymateuses humaines cellules souches (MSC)
Vidéos connexes
0 Vues
Dernière mise à jour : 29 août 2026