Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 2:42 min • July 8th, 2025
Les protéoglycanes sont composés d’une protéine centrale attachée de manière covalente à des chaînes de glycosaminoglycanes sulfatés.
Pour visualiser les protéoglycanes, commencez par des échafaudages à base de collagène - le substrat polymère poreux - et ensemencez-y la suspension de cellules souches mésenchymateuses, ou CSM. Cela fournit un support structurel aux MSC et leur permet de se développer à la surface ainsi qu’à l’intérieur des cavités des échafaudages.
Traiter les constructions dans un milieu de différenciation chondrogénique contenant des facteurs de croissance transformants qui entraînent la transformation des CSM en chondrocytes matures - cellules cartilagineuses. Les chondrocytes matures sécrètent des protéoglycanes qui forment un réseau avec le collagène de l’échafaudage.
Prenez une section préparée à partir de la construction chargée de chondrocytes. Ajouter une solution acide de colorant bleu d’alcian complétée par du chlorhydrate de guanidium et incuber. Pendant l’incubation, le chlorhydrate de guanidine dans la solution de colorant dissocie tous les agrégats de protéoglycanes pour une meilleure coloration.
Par la suite, les glycosaminoglycanes sulfatés chargés négativement des protéoglycanes se lient aux molécules de colorant bleu d’alcian chargées positivement contenant du cuivre, ce qui entraîne des dépôts bleus.
Ensuite, plongez la lame dans une solution de décoloration contenant du chlorure de magnésium. Les ions magnésium entrent en compétition avec les molécules de colorant chargées positivement pour se lier aux sites de liaison sur les glycosaminoglycanes, empêchant ainsi la surcoloration.
Imagez la section. La coloration bleue confirme la présence de protéoglycanes dans l’échantillon
Pour réaliser une différenciation chondrogénique à partir d’un dispositif médical en forme d’éponge constitué de collagène lyophilisé de type 1, coupez des cubes de 3 millimètres de côté. Grainez les CSM sur les cubes à une concentration de 4 x 106 cellules/ml.
Après avoir laissé les cellules adhérer aux cubes pendant 30 minutes à température ambiante, maintenez les constructions de collagène MSC dans un milieu chondrogénique, comme indiqué dans le protocole de texte. Ajoutez 0,4 % de solution de bleu d’Alcian aux sections et incubez toute la nuit à 4 degrés Celsius.
Le lendemain, utilisez 40 % de DMSO et 0,05 molaire de chlorure de magnésium pour laver les cellules pendant 30 minutes avant d’utiliser du rouge nucléaire pour contre-colorer les cellules.