JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniques biologiques
0 vues • 4:14 min • July 8th, 2025
Les fibroblastes cardiaques activés par le stress déposent un excès de collagène dans les régions blessées, une condition appelée fibrose, qui altère la fonction cardiaque.
Pour visualiser l’étendue de la fibrose, sectionnez d’abord les blocs cardiaques inclus dans la paraffine. Placez les sections sur une diapositive. Chauffez la lame pour faire fondre la paraffine, permettant aux sections d’adhérer.
Trempez la lame dans du xylol pour déparaffiniser le tissu. Traitez les sections avec des concentrations d’alcool décroissantes, pour réhydrater les sections et faciliter la liaison ultérieure des composants aqueux de la teinture
.Incuber les sections dans un fixateur acide qui réticule les protéines, stabilisant ainsi la structure tissulaire. Rincer à l’eau pour éliminer les résidus de fixateur.
Immergez la lame dans une solution d’hématoxyline. Le colorant cationique se lie à l’ADN chargé négativement, colorant le noyau en bleu. Rincer à l’eau pour enlever l’excès de tache.
Incuber la lame dans de l’acide Fuchsin-Ponceau, un colorant anionique à petites molécules qui interagit avec les protéines cytoplasmiques chargées positivement et le collagène, les colorant en rouge. Traiter avec de l’acide acétique dilué, pour enlever l’excès de tache.
Immergez la lame dans une solution d’acide phosphomolybdique-Orange G. L’orange G, un colorant à petites molécules, colore les érythrocytes en rouge orangé. L’acide phosphomolybdique, un acide à grosses molécules, expulse les colorants à petites molécules du collagène, le rendant incolore.
Incuber les sections dans un colorant vert clair, dont les molécules lient les fibres de collagène, les colorant en vert. Au microscope, les régions fibrotiques apparaissent en vert, indiquant un dépôt excessif de collagène.
Dans cette procédure, préparez des coupes de tissus de cinq microns d’épaisseur à partir des blocs de paraffine avec un microtome manuel. Ensuite, colorez une lame de chaque section de cœur, pour chaque rat, avec une coloration trichrome Masson-Goldner. Pour les sections de paraffine, faites fondre les tissus à 60 degrés Celsius dans un four. Sous une hotte, déparaffinisez-les au xylol deux fois, pendant 10 minutes chacune.
Ensuite, réhydratez-les dans de l’éthanol à 100 %, à 95 % d’éthanol, à 70 % d’éthanol, puis dans de l’eau distillée pendant trois minutes chacun. Pour les sections déparaffinés, et pour les cryosections, fixez-les dans la solution de Bouin pendant la nuit. Le lendemain matin, rincez-les à l’eau courante du robinet pendant 10 à 15 minutes. Ensuite, rincez à nouveau à l’eau distillée.
La fixation à Bouin est l’étape la plus importante pour assurer une splendide coloration Goldner.
Incuber-les dans l’hématoxyline de Mayer pendant trois minutes. Après 3 minutes, retirez les lames et laissez-les dans de l’eau distillée pendant cinq minutes. Ensuite, incubez-les dans du Fuchsin Ponceau-acide pendant cinq minutes, avant de les rincer avec de l’acide acétique à 1 % pendant une minute.
Ensuite, incubez les sections dans de l’acide phosphomolybdique Orange G pendant une minute, puis rincez-les dans de l’acide acétique à 1 % pendant une minute. Incuber dans un colorant vert clair pendant 10 minutes, puis rincer dans de l’acide acétique à 1 % pendant une minute. Enfin, déshydratez les sections dans de l’éthanol à 70 % pendant 30 secondes, à 95 % d’éthanol pendant 30 secondes et à 100 % d’éthanol pendant cinq minutes séquentiellement. Appliquez une goutte de produit de montage résineux sur les sections de tissus, couvrez-les de lamelles et mettez-les à sécher.