Coloration Sudan IV : une procédure pour colorer les plaques d’athérosclérose chargées de lipides dans l’arc aortique de souris récolté

L’athérosclérose se produit en raison de l’accumulation de lipoprotéines dans la paroi interne des artères, entraînant une accumulation de plaque, un épaississement et un rétrécissement des artères et une réduction du flux sanguin.

Les plaques sont constituées d’un capuchon fibreux avec des cellules musculaires lisses et une matrice extracellulaire, renfermant un noyau composé de lipoprotéines de basse densité, de LDL - des particules sphériques avec un noyau hydrophobe d’esters de cholestérol et de triglycérides, entourés d’une couche externe de phospholipides - ainsi que des cellules inflammatoires.

Pour visualiser des plaques d’athérosclérose riches en lipides, procurez-vous un arc aortique de souris fraîchement récolté. Transférez-le sur une plate-forme personnalisée à fond sombre pour un meilleur contraste lors de l’imagerie à grande échelle. Ajouter un tampon pour éviter la déshydratation des tissus.

Retirez le tissu adipeux périvasculaire entourant l’arc aortique pour éviter les fausses taches de fond. Incisez l’aorte et ses branches longitudinalement à travers la lumière pour exposer la surface la plus interne avec l’accumulation de plaque d’athérosclérose.

Fixez l’arc aortique ouvert sur la plate-forme et incubez dans de l’éthanol. L’éthanol déplace l’eau des tissus, inactivant les protéines et préservant l’architecture tissulaire.

Traiter avec la coloration Sudan IV solubilisée dans des solvants organiques. À l’intérieur de la plaque, Sudan IV, un colorant diazoïque liposoluble ayant une grande affinité pour les triglycérides et les esters de cholestérol des lipoprotéines, passe de la phase solvant organique et se lie au noyau hydrophobe des lipides des LDL, formant des complexes stables. Éliminez l’excès de tache à l’aide d’éthanol.

Au stéréomicroscope, les plaques d’athérosclérose riches en lipides colorées apparaissent rouge orangé, tandis que les zones non placiformes apparaissent pâles.

Pour préparer un lit d’épinglage pour l’analyse en face, pliez un segment de film de cire de paraffine 8 fois pour obtenir une surface plane de 25 x 25 millimètres, et enroulez du ruban isolant électrique noir autour du film pour créer un fond sombre pour l’aorte.

Placez une étiquette à l’arrière du lit d’épinglage et utilisez un crayon de plomb pour noter le numéro d’identification de la souris. Transférez l’arc aortique sur le lit d’épinglage et ajoutez une goutte de PBS au tissu. À l’aide d’un stéréomicroscope, nettoyez l’aorte du tissu adipeux péri-adventice restant et utilisez des ciseaux Vannas et une pince Dumont pour décoller doucement tout le tissu adipeux environnant sans manipuler ni endommager l’aorte.

Ensuite, introduisez les ciseaux Vannas dans la lumière aortique pour exposer la surface intimale. Commencez à couper la courbure externe de l’arc ascendant dans la direction distale en continuant à ouvrir les branches, y compris l’artère brachiocéphale, et en épargnant la partie dorsale de la région thoracique descendante.

Pour afficher la surface intimale, coupez la petite courbure et pliez l’aorte. À l’aide d’un porte-aiguille micro Castroviejo, fixez l’arcade ouverte au lit d’épinglage avec l’extrémité émoussée des épingles à insectes minutien sans étirer l’échantillon, en pliant doucement les broches pour les éloigner de l’échantillon, pendant que le tissu est maintenu en place. Ensuite, conservez l’arc épinglé face vers le bas dans une boîte de Pétri de PBS à 4 degrés Celsius.

Pour la coloration Sudan IV, rincez l’échantillon pendant 5 minutes dans une boîte de Pétri contenant de l’éthanol à 70 %, l’arcade vers le bas, avant de transférer l’échantillon dans une boîte de solution de travail Sudan IV pendant 7 minutes.

À la fin de l’incubation, rincez l’échantillon avec deux lavages de 3 minutes à l’éthanol à 80 % pour décolorer la surface intimale normale, suivis d’un rinçage final au PBS, avant de remettre le tissu dans sa boîte de Pétri d’origine. Ensuite, acquérez des micrographies sous un stéréomicroscope connecté à un appareil photo numérique à un grossissement de 10X, en obtenant des images de l’arc épinglé immergé dans le PBS, en utilisant de petits poids métalliques pour maintenir le lit d’épinglage au fond de la boîte de Pétri.