Purification de protéines basée sur la chromatographie d’affinité du nickel : une technique pour purifier des protéines recombinantes marquées à la polyhistidine à partir d’un lysat de cellules bactériennes

Pour purifier la protéine recombinante fusionnée à un marqueur poly-histidine - une chaîne de résidus d’histidine à une extrémité - à partir d’un lysat de cellule bactérienne, diluez d’abord le lysat cellulaire pour éviter le colmatage de la colonne pendant l’exécution chromatographique.

Assembler une colonne d’affinité contenant des cations nickel divalents immobilisés sur une matrice de billes d’agarose à l’aide d’acide nitrilotriacétique, un agent chélateur. L’acide nitrilotriacétique se lie aux cations nickel via quatre sites covalents de coordination, tandis que deux sites sur l’ion métallique restent disponibles pour des interactions avec des marqueurs polyhistidines dans la protéine d’intérêt.

Équilibrez la colonne avec un tampon approprié pour optimiser les conditions d’interactions métal-protéine efficaces. Chargez le lysat cellulaire sur la colonne.

Les protéines recombinantes, portant des résidus d’histidine terminaux accessibles, forment des liaisons de coordination avec les cations nickel en raison de la grande affinité de l’ion métallique pour l’imidazole, la chaîne latérale de l’histidine, et se lient à la matrice. Le nombre élevé d’histidines consécutives dans la protéine recombinante renforce son attachement à la matrice.

En comparaison, les protéines dépourvues de résidus d’histidine n’adhèrent pas à la colonne et s’éluent en continu. Lavez la colonne avec un tampon imidazole peu concentré.

L’imidazole entre en compétition avec des contaminants protéiques faiblement liés qui peuvent avoir adhéré de manière non spécifique à la matrice via des résidus d’histidine dans leur chaîne polypeptidique, les déplaçant et facilitant l’élution. Laver la colonne avec un tampon d’imidazole hautement concentré pour dissocier les protéines recombinantes marquées à l’histidine fortement liées du chélate d’ions nickel, en les éluant en continu.

Prélever la fraction de protéine recombinante purifiée pour une analyse plus approfondie.

Commencer ce protocole par une surexpression inductible d’une protéine marquée à l’histidine, comme décrit dans le protocole textuel. Préparez 1 millilitre de résine de nickel-acide nitriloacétique dans une colonne gravitaire, pour purifier la protéine. La veille de l’utilisation, équilibrez la colonne pendant la nuit à 4 degrés Celsius avec 2 millilitres de tampon d’équilibrage.

Le lendemain, amenez la colonne de 4 degrés Celsius à température ambiante, avant de charger le lysat clarifié, et laissez-la reposer pendant environ deux à trois heures. Ensuite, mettez à nouveau la pastille en suspension dans le tampon de lyse.

Soniquez les cellules sur de la glace 10 fois à des intervalles de 10 secondes, en faisant une pause de 30 secondes entre les impulsions. Clarifier le lysat par centrifugation à 3080 x g pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius à l’aide d’une microcentrifugeuse.

Préparez le lysat clarifié avec des volumes égaux de tampon de lyse, puis appliquez le lysat clarifié préparé sur la colonne et recueillez le flux. Appliquez à nouveau le flux de lysat clarifié sur la colonne et recueillez le flux secondaire.

Ensuite, lavez la colonne avec 5 millilitres de tampon de lavage #1 et récupérez le flux. Lavez à nouveau la colonne avec 5 millilitres de tampon de lavage #2 et récupérez le flux. Maintenant, appliquez 2 millilitres de tampon d’élution. Recueillir le débit en deux fractions de 1 millilitre chacune.